纤维素样品负染色，微观形貌与尺寸表征

　　纤维素样品做负染色，主要用于 TEM 观察其微观形貌、分散状态和尺寸分布，尤其适合纳米纤维素、纤维素纳米纤丝、纤维素纳米晶等低电子密度、纤维状样品。 由于纤维素本身对电子束衬度较低，负染色后纤维在暗背景中呈亮色轮廓，更容易测量直径、长度和聚集形态。

　　推荐负染色流程

　　1. 样品预处理

　　将纤维素分散液稀释至合适浓度，通常可先尝试 0.01%–0.5%。浓度过高容易堆叠、缠结;浓度过低则视野中纤维太少，不利于统计。

　　若样品含盐、缓冲盐或表面活性剂较多，建议先用超纯水或低浓度挥发性缓冲液置换，避免干燥后产生盐结晶。

　　2. 载网准备

　　常用 碳支持膜铜网，使用前可做辉光放电亲水处理，使样品液滴均匀铺展，减少边缘聚集。

　　3. 吸附样品

　　取 3–5 μL 样品滴加到载网膜面，静置 30–60 秒，让纤维吸附到支持膜上。

　　用滤纸从载网边缘吸去多余液体，注意不要直接触碰膜面。

　　4. 清洗

　　滴加 1–2 滴超纯水，停留数秒后吸干，用于去除残留盐和杂质。此步对减少背景结晶很重要。

　　5. 负染色

　　可选两种常用染色体系：

　　磷钨酸染色：常用 1%–3% 磷钨酸，pH 调至约 6.5–7.0，染色 20–60 秒。

　　醋酸铀染色：常用 1%–2% 醋酸铀/醋酸双氧铀，染色 20–60 秒。

　　纤维素样品更常用磷钨酸;醋酸铀衬度更强，但需注意其放射性和毒性，并避免与磷酸盐缓冲液接触产生沉淀。

　　6. 吸干与干燥

　　染色后用滤纸吸去多余染液，可再用超纯水快速漂洗一次，随后室温自然干燥 10 分钟以上。

　　若干燥不彻底，电镜下易出现污染或漂移。

　　7. 电镜观察

　　一般可在 80–120 kV 下观察。 纤维素属于软物质，电子束敏感，建议低剂量观察，避免长时间聚焦同一区域导致纤维收缩、断裂或漂移。

　　形貌与尺寸表征要点

　　观察时可重点记录：

　　纤维直径：单根纤丝直径、束状聚集体直径;

　　纤维长度：尽量选取分散较好的单根纤维测量;

　　长径比：长度/直径，用于评价解纤程度;

　　分散状态：是否存在团聚、缠结、网络结构;

　　表面特征：纤维边缘是否清晰、是否有颗粒附着或表面粗糙度。

　　由于负染色是在空气干燥条件下成像，纤维素纤维可能出现一定程度的塌陷、收缩或聚集，因此测得的尺寸通常只能作为干态近似值。 若需要更准确的横向尺寸或聚集态信息，建议结合 AFM、SAXS 或 DLS 等方法交叉验证。

　　常见问题与优化

　　背景结晶多：多为盐浓度高或染液过浓，可降低染液浓度、增加水洗次数。

　　纤维堆叠严重：样品浓度过高，需进一步稀释或缩短吸附时间。

　　纤维吸附少：载网亲水性不足，可增加辉光放电时间或改用亲水支持膜。

　　衬度不足：可尝试提高磷钨酸浓度至 2%–3%，或改用醋酸铀染色。

　　结构变形：干燥过程过快或电子束剂量过高，建议自然干燥并降低曝光强度。

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