细胞生物方案定制

细胞生物实验：细胞增殖及毒性检测、细胞迁移/侵袭实验、细胞克隆形成实验（PCF)、小管形成实验等。

细胞毒性检测是生物相容性测试的一种，检测药物或者新型材料在生物环境中的毒性情况，即通过检测材料或者药物对细胞的增殖或者生长的影响，来评价药物或材料的毒性或者活性，主要用于药物活性筛选、细胞增殖/毒性测定、抗肿瘤药效计算IC50等;常用MTT法或者CCK8法检测，另外也可以通过Live/dead双染法进行细胞成像，更直观的记录细胞的存活情况。

1.CCK-8测试

实验原理：CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂)中含有WST–8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。注：贴壁细胞和悬浮细胞均可使用此方法，悬浮细胞CCK-8孵育时间应适当延长。

服务流程：

2.MTT测试

实验原理：活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能;二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臢，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，使用多功能酶标仪在490nm处测定其吸光值，从而定量测定细胞的存活比例。注：多用于贴壁细胞。

服务流程：

3、Live/Dead细胞染色

活/死细胞复染试剂盒可同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。该试剂盒包含钙黄绿素-AM和碘化丙啶(PI)两种溶液，分别用于染色活细胞和死细胞。其中钙黄绿素-AM，即钙黄绿素的乙酰羟甲基酯，具有高度亲脂性和细胞膜透过性。尽管钙黄绿素-AM自身并非荧光分子，但活细胞中的酯酶可以催化钙黄绿素-AM生成钙黄绿素，从而发出强烈的绿色荧光(λex 490 nm, λem 515 nm). 因此钙黄绿素-AM只能染色活细胞。而核染色染料PI不能透过活细胞的细胞膜。但可以透过死细胞膜的变性区域来到达细胞核，并与细胞中的DNA双螺旋结构结合，从而发出红色荧光(λex 535 nm, λem 617 nm)。钙黄绿素和PI-DNA都能被490nm波长的光激发，因此可以采用荧光显微镜同时监测活细胞和死细胞。使用λex激发光时只能观察到死亡细胞。

服务流程：

细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。

1、细胞划痕

细胞划痕(修复)法是一种简捷的测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，使用枪头或者其他硬物在单层细胞的中央区划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间(采用低血清或者无血清培养基培养以排除细胞增殖的影响)，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长(修复)至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，服务流程如下：

准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)

(1)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

(2)在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

(3)第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

(4)用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

(5)放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

2、细胞侵袭

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究，服务流程如下：

克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。

根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验(PCF)和软琼脂克隆形成实验(SACF)。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞;缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞(如正常成纤维细胞)不适用此法。

软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞(如正常成纤维细胞)在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。

克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

小管形成实验(Tube Formation Assay)是一种重要的生物医学研究方法，主要用于模拟体内血管生成过程，特别是在肿瘤血管生成和血管生成拟态(Vasculogenic  Mimicry,VM)的研究中广泛应用。

1、实验原理

小管形成实验能够模拟人体内毛细血管生成的过程，包括内皮细胞出芽增值和毛细血管网结构形成等步骤，接近人体血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶(如Matrigel)、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时，能够形成网状结构，通过电子显微镜分析小管间的紧密连接，从而定量评估血管生成情况。

2、实验材料

细胞：常用的有内皮细胞(如人脐静脉内皮细胞HUVEC)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人类诱导多能干细胞(iPSC)等。

基质胶：如Matrigel，它含有层粘连蛋白、胶原蛋白等生长因子，能够模拟体内细胞外基质环境。

培养基：含适当浓度胎牛血清(FBS)的DMEM等细胞培养基。

实验器材：96孔板、细胞培养箱、显微镜、移液枪及枪头等。

3、实验步骤

基质胶准备：将Matrigel基质胶提前放入4℃冰箱过夜解冻，然后用预冷的枪头混匀，避免产生气泡。将适量基质胶均匀铺入96孔板底部，每孔约50-80μL，放入37℃细胞培养箱中孵育30分钟至1小时，使基质胶固化。

细胞准备：将内皮细胞培养至80-90%融合度时，进行消化、计数，并用含适当浓度FBS的培养基重悬细胞，调整至适宜的细胞密度(如1×104至2×104cells/well)。

细胞接种：将细胞悬液加入含基质胶的96孔板中，每孔约100μL，避免产生气泡。将96孔板放回37℃细胞培养箱中继续培养。

观察与拍照：在培养一定时间后(如6小时、12小时等)，使用显微镜观察小管形成情况，并拍照记录。根据需要，可进行荧光染色以增强观察效果。

4、注意事项

细胞状态：选择代数较少、状态良好的细胞进行实验，以保证小管形成的成功率和质量。

基质胶选择：不同品牌和型号的基质胶在生长因子含量和物理性质上可能存在差异，需根据实验需求进行选择。

铺胶技巧：铺胶时需避免产生气泡和过度稀释基质胶，以免影响细胞成管效果。

细胞密度：掌握好铺板的细胞密度，密度过低或过高均可能影响小管形成。

拍照时机：在最佳时间点进行拍照记录，以保证图像清晰、数据准确。

5、实验应用

小管形成实验被广泛应用于血管生成、肿瘤血管生成拟态、干细胞多能性验证等领域的研究中。通过该实验，可以评估不同因素对血管生成的影响，为相关疾病的诊断和治疗提供理论和实验依据。同时，该实验也是研究细胞再生能力和组织工程的重要手段之一。