SDS-PAGE 蛋白电泳染色实验流程与常见问题

　　SDS-PAGE 染色实验可以按“电泳结束 → 固定 → 染色 → 脱色 → 成像”来做。常用染色有考马斯亮蓝、银染、荧光染色和可逆染色;考马斯亮蓝适合常规检测，银染灵敏度高但背景和操作要求更高。

　　一、考马斯亮蓝 R-250 染色流程

　　1. 固定

　　电泳结束后，将凝胶放入固定液中，摇床缓慢振荡固定 1–2 小时。

　　常用固定液：甲醇 50%、冰醋酸 10%、水 40%。

　　2. 染色

　　弃固定液，加入考马斯亮蓝 R-250 染色液，室温摇动染色 1–4 小时。

　　常规染色液：考马斯亮蓝 R-250 0.1%、甲醇 40%、冰醋酸 10%。

　　快速染色可用微波加热至接近沸腾后室温摇动 5–10 分钟，但低浓度胶易碎裂，需谨慎。

　　3. 水洗

　　用蒸馏水或去离子水漂洗数次，去除多余染料。

　　4. 脱色

　　加入脱色液，室温摇动 4–24 小时，期间更换脱色液 2–4 次，直到背景清晰、条带明显。

　　常用脱色液：甲醇 10%、冰醋酸 7%、水 83%;也可用甲醇 50 mL、冰醋酸 35 mL、水补足至合适体积。

　　5. 保存与成像

　　脱色后凝胶可保存在 7%–10% 冰醋酸或含 20% 甘油的水中，尽快拍照。

　　二、银染流程

　　银染灵敏度可达纳克级，适合低丰度蛋白检测，但对水、容器、试剂和温度更敏感。

　　1. 固定

　　固定液：乙醇 50 mL、冰醋酸 10 mL、水 40 mL;固定 40 分钟至过夜。

　　2. 洗涤

　　30% 乙醇洗 10 分钟，再用超纯水洗 10 分钟。

　　3. 敏化

　　加入敏化剂，室温孵育 10 分钟，再用超纯水洗 2 次，每次 10 分钟。

　　4. 银染

　　加入银溶液，室温避光孵育 10 分钟。

　　5. 漂洗

　　用超纯水漂洗 1.5 分钟，时间不宜过长，否则条带会变浅。

　　6. 显影

　　加入显影液，缓慢振荡 3–7 分钟，条带出现后及时终止。

　　7. 终止与保存

　　加入终止液孵育 5 分钟，再用超纯水洗 15 分钟。

　　银染后应尽快拍照，条带会随时间变浅，背景可能加深。

　　三、常见问题与排查

　　无条带或条带很淡

　　上样量不足，建议增加蛋白量或设置 BSA 阳性对照。

　　样品未充分变性或还原剂失效，蛋白未进入凝胶。

　　染色时间太短、染色液失效或染色液未覆盖凝胶。

　　银染时蛋白半胱氨酸含量低、银染后水洗过长、固定后乙酸残留，都会使条带变浅。

　　背景过深

　　脱色不充分，需更换脱色液并延长脱色时间。

　　染色液或容器被污染，染色液应过滤后使用。

　　银染背景深多与显色时间过长、洗涤不充分、水纯度低、容器不洁净有关。

　　条带模糊、拖尾或呈“鬼带”

　　样品未离心，存在沉淀或溶解不充分。

　　凝胶聚合不均、胶孔变形、上样量过大。

　　还原剂被氧化会导致蛋白重新聚集，出现异常条带。

　　电压过高、产热不均也会造成条带变形。

　　条带弯曲变形

　　“微笑”形条带：多因凝胶中部过热，可降低电压或改善散热。

　　“皱眉”形条带：多因胶底部有气泡或聚合不均。

　　条带歪斜：可能因电泳槽装配不正、胶孔不整齐或上样时戳破胶孔。

　　染色后出现指纹、斑点或非特异痕迹

　　操作时未戴手套，手接触凝胶。

　　染色液未过滤，存在未溶解染料颗粒。

　　银染时容器不洁净或水中杂质较多。

　　四、染色方法选择建议

　　常规蛋白检测、表达验证、纯度检查：优先用考马斯亮蓝 R-250。

　　低丰度蛋白、微量样品：选银染或荧光染色。

　　后续做 Western blot 或质谱：优先选可逆染色或质谱兼容染色;传统银染因甲醛交联可能影响质谱。

　　需要快速出结果：可用快速考马斯亮蓝染色或快速银染试剂盒。

       来源：网络