肾脏肾小球半薄定位染色，观察组织内部超微结构

　　“肾脏肾小球半薄定位染色”是肾活检电镜制样中的关键步骤：先用环氧树脂包埋肾组织，切出约 1 μm 厚的半薄切片，经染色后在光镜下确认肾小球位置，再据此修整包埋块，切出 50–100 nm 超薄切片，z后进行铀铅双染并上机观察超微结构。

　　流程

　　1. 取材与固定

　　肾穿刺组织应尽量新鲜，电镜组织块宜小于 1 mm³，z好能取到含肾小球的皮质区。

　　常用双重固定：

　　前固定：2%–4% 戊二醛，4℃;

　　后固定：1% 四氧化锇。

　　固定后需用缓冲液充分漂洗，再进行梯度脱水。

　　2. 脱水、渗透与包埋

　　依次用乙醇或丙酮梯度脱水，再用环氧树脂(如 Epon812)渗透并包埋，60℃聚合形成包埋块。

　　3. 修块与半薄切片

　　在体视显微镜下修整包埋块，暴露组织面;用超薄切片机切出约 0.5–2 μm 的半薄切片，贴附于载玻片上。

　　4. 半薄切片染色定位

　　肾组织半薄定位常用 甲苯胺蓝染色。

　　可选操作：

　　环氧树脂包埋切片可先做脱树脂或过碘酸处理，提高染色通透性;经锇酸固定的组织必要时可用 1% 过碘酸短时处理，减少锇酸对染色的影响。

　　滴加 0.5%–1% 甲苯胺蓝染液，微热或 45–60℃染色约 1–2 分钟;水洗后可用 95% 酒精短时分化，镜下控制颜色，烤干后光镜观察。

　　光镜下选择含肾小球的区域，重点观察：肾小球毛细血管袢、系膜区、基底膜大致形态、足细胞及内皮细胞区域。确认目标肾小球后，在包埋块表面进一步修整，使后续超薄切片正好落在该区域。

　　5. 超薄切片与电镜染色

　　切出 50–100 nm 超薄切片，用铜网捞片;随后进行 醋酸铀 + 柠檬酸铅双染，以提高细胞膜、基底膜、线粒体、内质网、核糖体、电子致密沉积物等结构的反差。

　　6. 观察重点

　　电镜下可观察：

　　肾小球基底膜厚度、分层、钉突样改变;

　　足细胞足突融合或脱落;

　　内皮细胞窗孔及肿胀;

　　系膜基质增生与电子致密物沉积部位;

　　免疫复合物样沉积、胶原纤维样结构或其他异常沉积物。

　　注意事项

　　半薄切片只用于“定位”，不能直接用于电镜超微结构观察。

　　取材要快、小、轻，避免挤压、牵拉和干燥。

　　锇酸有毒且易挥发，需在通风条件下规范操作。

　　甲苯胺蓝染色时间、分化程度和树脂类型都会影响颜色对比，建议先用废片摸索条件。

　　若需在同一标本上兼顾光镜与电镜，也可考虑 LR White 等亲水性树脂，但固定和染色条件需相应调整。

       来源：网络