ITC 分子互作检测：原理、样品要求与数据解读指南

　　ITC，即等温滴定量热法，是目前分子相互作用研究中常用的“金标准”技术之一。它无需荧光标记、固定化或表面偶联，直接在溶液状态下测量两种分子结合时释放或吸收的热量，从而一次性获得结合常数、化学计量比、焓变、熵变和自由能变等完整热力学信息。

　　对于药物靶点验证、蛋白-小分子结合、抗体-抗原识别、多肽-蛋白互作、核酸-小分子结合以及酶-抑制剂研究，ITC 都能提供较直接的亲和力与热力学证据。

　　一、ITC 检测原理

　　ITC 仪器通常包含样品池和参比池。样品池中放置被滴定物，例如蛋白、核酸或大分子;滴定针中放置配体，例如小分子、多肽或另一蛋白。实验过程中，配体被分多次注入样品池，每次结合反应都会引起微小热量变化。仪器通过反馈加热功率维持两池温度一致，从而记录每次注射的热功率变化。

　　随着滴定进行，样品池中的结合位点逐渐被占据，热信号由强变弱，z终达到饱和。对热谱图积分后，可拟合得到：

　　KD / Ka：反映结合亲和力;

　　n：反映化学计量比或结合位点数;

　　ΔH：反映结合过程的焓变;

　　ΔS：反映熵变;

　　ΔG：由 ΔG = ΔH − TΔS 计算得到，反映结合自由能。

　　其中，ΔH 主要体现氢键、范德华力等直接相互作用;ΔS 则与疏水效应、构象变化和溶剂水分子重排有关。通过 ΔH 和 ΔS 的相对贡献，可进一步判断结合是“焓驱动”还是“熵驱动”。

　　二、ITC 技术优势

　　无需标记：不依赖荧光、放射性或表面固定，保持分子天然状态;

　　溶液相检测：更接近生理环境，减少固相修饰带来的偏差;

　　一次实验获得完整热力学参数：可同时得到 KD、n、ΔH、ΔS、ΔG;

　　适用范围广：可用于蛋白-蛋白、蛋白-小分子、蛋白-核酸、核酸-小分子、酶-底物/抑制剂等体系;

　　不受样品颜色、浊度或荧光干扰：检测对象为热量变化，而非光信号。

　　三、ITC 样品要求

　　ITC 对样品纯度、浓度准确性和缓冲液一致性要求较高。

　　1. 纯度

　　样品纯度建议达到 90% 以上，可通过 HPLC 或 SDS-PAGE 评估。杂质可能带来额外稀释热或假结合信号，影响基线稳定性。

　　2. 澄清度

　　样品应澄清、无气泡、无可见沉淀。上机前建议离心或 0.22 μm 过滤，并进行真空脱气，避免气泡进入样品池。

　　3. 缓冲液匹配

　　滴定针样品与样品池样品必须使用完全一致的缓冲体系，包括 pH、盐浓度、甘油、DMSO、去垢剂等。pH 差异通常应控制在 0.05 以内，否则会产生明显稀释热背景。

　　4. 浓度准确性

　　样品池中被滴定物的浓度误差会影响 n 值;滴定针中配体的浓度误差会影响 KD 和 ΔH。因此建议使用 A280、HPLC 或氨基酸分析等方法准确测定摩尔浓度。

　　5. 样品量

　　不同仪器和实验设计消耗量差异较大。常规 ITC 样品池体积约 200 μL 至 1.44 mL，滴定针体积约 40–100 μL。 实际送样量需考虑润洗、脱气、空白滴定和重复优化，通常建议：

　　蛋白样品：准备数百微克至毫克级更稳妥;

　　小分子样品：建议准备足够配制数百微升至数毫升高浓度母液;

　　缓冲液：应预留足量，用于稀释、匹配和空白滴定。

　　具体用量应以所用仪器型号和实验方案为准。

　　四、浓度设计与 C 值

　　ITC 实验成功的关键之一是合理设计浓度。常用 Wiseman C 值进行判断：

　　C = [样品池浓度] × n / KD

　　C 值在 10–100：通常可获得较理想的 S 形结合曲线，适合准确拟合 KD;

　　C 值过低：曲线难以饱和，KD 拟合不稳定;

　　C 值过高：曲线过于陡峭，KD 难以准确测定，可能需要采用竞争 ITC。

　　若 KD 未知，可先按经验浓度尝试。例如蛋白样品池 10–50 μM，滴定针浓度为样品池的 10–20 倍;小分子-蛋白体系也可先尝试 200 μM 小分子滴定 20 μM 蛋白，再根据信号强度调整。

　　五、实验流程

　　体系评估：确认分子对、预期 KD、缓冲液组成、是否含 DMSO 或去垢剂。

　　样品制备：纯化、透析或超滤，使滴定针与样品池缓冲液完全一致。

　　脱气与离心：去除气泡和微小颗粒，防止进样异常。

　　空白滴定：进行“配体-缓冲液”对照实验，扣除稀释热。

　　正式滴定：设置注射次数、注射体积、间隔时间和搅拌速度。

　　数据拟合：选择合适的结合模型，获得 KD、n、ΔH、ΔS、ΔG。

　　结果验证：必要时重复实验或结合 SPR、MST、BLI 等技术交叉验证。

　　六、常见问题与优化

　　基线漂移：多由气泡、颗粒、缓冲液不匹配或样品不稳定引起;

　　信号过弱：可提高浓度、优化温度或更换缓冲体系;

　　曲线不呈 S 形：检查 C 值是否过低或过高;

　　DMSO 背景热明显：确保滴定针与样品池 DMSO 浓度一致;

　　还原剂干扰：DTT、β-巯基乙醇可能产生背景热，优先使用 TCEP 并控制浓度;

　　强酸强碱或高浓度有机溶剂：可能损坏样品池或产生严重背景热，应避免。

       来源：网络