细菌负染色 TEM 制样方法与形貌观测

　　细菌负染色TEM 主要用于快速观察菌体形态、大小、排列方式、表面结构、鞭毛、芽孢、荚膜样结构、噬菌体附着等。它不观察细菌内部超微结构;要看细胞壁层次、核区、内含物，需要超薄切片 TEM。

　　一、原理

　　负染色剂通常是电子密度高的重金属盐，如磷钨酸、醋酸铀、钼酸铵等。它们不进入菌体内部，而是沉积在菌体周围和表面凹陷处，形成暗背景;菌体本身电子密度低，在 TEM 下呈亮区，从而被“衬托”出来。

　　二、样品准备

　　取对数生长期细菌，菌体活性状态更稳定，鞭毛等表面结构不易脱落。

　　用无菌水或低盐缓冲液制成菌悬液，浓度一般控制在约 10⁸—10⁹ 个/mL。

　　若来自液体培养基，建议用纯水或低盐缓冲液轻柔清洗，避免高盐结晶干扰成像。

　　避免高转速离心、强涡旋和剧烈吹打，防止菌体破碎或鞭毛脱落。

　　若不能立即制样，可用 2.5% 戊二醛等固定液固定，4℃ 保存。

　　三、载网处理

　　常用带碳支持膜的铜网或镍网。上样前可做辉光放电或等离子亲水处理，使菌悬液在膜面铺展更均匀。

　　四、常用制样方法

　　1. 滴样法

　　取 3—5 μL 菌悬液滴在碳膜面上，静置 30 秒—2 分钟。

　　用滤纸从载网边缘吸去多余液体。

　　滴加负染液，如 1%—2% 磷钨酸，染色 30 秒—2 分钟。

　　吸去染液，必要时用纯水快速漂洗 1 次，再吸干。

　　室温自然干燥后上机观察。

　　2. 漂浮法

　　在封口膜或蜡板上滴加菌悬液。

　　将载网膜面朝下漂浮在液滴上，吸附 1—2 分钟。

　　吸干后，再将载网漂浮在染液滴上染色 1—2 分钟。

　　吸干、干燥后观察。

　　3. 混合法

　　将菌悬液与染液按约 1:1 混合。

　　取混合液滴在封口膜上，载网膜面朝下吸附 1—2 分钟。

　　吸干、干燥后观察。

　　五、染液选择与注意事项

　　磷钨酸：常用 1%—2%，pH 调至 6.5—7.4 更温和，适合多数细菌和鞭毛观察。

　　醋酸铀：0.5%—2%，反差强，但偏酸性，且会与磷酸盐反应产生沉淀。

　　染液使用前z好离心或过滤，避免沉淀造成假象。

　　若样品含 PBS 等高盐缓冲液，染色前建议用纯水或低盐缓冲液漂洗载网。

　　染色时间不宜过长，避免染液过度渗透或背景过厚。

　　六、TEM 观察要点

　　加速电压常用 80—120 kV。

　　先低倍筛选菌体分布均匀、背景适中的区域。

　　再中高倍观察菌体轮廓、表面结构、鞭毛、芽孢、荚膜样结构、菌体聚集状态等。

　　合格图像应呈现：暗背景中的亮菌体，菌体边缘清晰，背景无明显盐结晶或染液团聚。

　　七、常见问题

　　菌体堆积：样品浓度过高，需稀释。

　　视野中菌体太少：浓度过低或吸附时间不足。

　　背景结晶多：缓冲液盐浓度过高，或染液未过滤。

　　鞭毛脱落：菌龄偏老、离心过猛或固定不及时。

　　菌体变形：染液 pH 不当、浓度过高或干燥过快。

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