免疫共沉淀Co‑IP实验原理与样品准备注意事项

　　免疫共沉淀，简称 Co‑IP，是在非变性条件下利用抗体捕获目标蛋白，并检测其是否与其他蛋白形成复合物的方法。 它和常规免疫沉淀的区别在于：IP 主要用于富集单一蛋白，Co‑IP 则进一步看“被拉下来的蛋白有没有带着互作蛋白一起沉淀”。 由于 Co‑IP 依赖天然构象和非共价相互作用，样品准备阶段关键的是：裂解要温和、温度要低、抑制剂要全、对照要齐。

　　一、Co‑IP 实验原理

　　在生理或近生理条件下裂解细胞后，诱饵蛋白与互作蛋白仍以复合物形式存在。加入针对诱饵蛋白的特异性抗体后，抗体与诱饵蛋白结合;再通过 Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠捕获抗体‑抗原复合物，使互作蛋白一同被沉淀下来。洗涤去除非特异性吸附后，洗脱复合物，z后用 Western Blot 或质谱检测互作蛋白。

　　需要注意，Co‑IP 能证明两种蛋白在裂解体系中处于同一复合物，但不能直接区分直接结合还是间接结合;低亲和力、瞬时互作也较难捕获。

　　二、样品准备的关键注意事项

　　1. 裂解液要温和，避免破坏蛋白复合物

　　Co‑IP 通常选用含 NP‑40、Triton X‑100 等非离子型去垢剂的裂解液。 这类去垢剂能增溶细胞膜并释放胞质蛋白和可溶性膜蛋白，同时尽量保留蛋白天然构象和相互作用界面。

　　不建议直接使用含 SDS、高浓度脱氧胆酸钠 的强变性裂解液，因为它们会破坏非共价相互作用，导致弱互作或瞬时互作在 IP 前就解离。 如果目标蛋白是核蛋白或强膜结合蛋白，可以在温和裂解基础上适度调整去垢剂浓度或超声条件，但应先确认互作是否仍能保留。

　　2. 全程低温操作

　　样品处理、裂解、孵育、洗涤都应尽量在 4℃ 或冰上完成。 室温放置会加速蛋白酶降解，也会增加复合物解离风险。裂解液、PBS、离心管、磁珠平衡液等z好提前预冷。

　　3. 必须添加蛋白酶抑制剂，必要时加磷酸酶/去乙酰化酶抑制剂

　　裂解前在裂解液中现加蛋白酶抑制剂，可防止目标蛋白和互作蛋白被降解。 若研究磷酸化、乙酰化等翻译后修饰相关的互作，还需加入相应的磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂。

　　4. 控制裂解强度，避免过度超声

　　细胞裂解可采用冰上孵育、轻柔吹打或低功率短时超声。超声有助于破碎细胞核和降低样品黏度，但功率过高或时间过长可能破坏蛋白复合物。 建议先做小规模预实验，比较不同裂解条件下 Input 中目标蛋白和互作蛋白的保留情况。

　　5. 离心取上清，避免细胞碎片和未裂解物质进入后续步骤

　　裂解后通常在 4℃、12,000–14,000 × g 离心 10–20 分钟，取上清用于后续 IP。 沉淀中可能含有未裂解细胞、细胞核碎片或不溶性蛋白，若带入磁珠体系会增加非特异性吸附。

　　6. 预留 Input 样本

　　裂解后应立即取一部分上清作为 Input，用于验证目标蛋白和候选互作蛋白在样本中确实表达。 没有 Input 对照时，IP 阴性结果很难判断是“没有互作”还是“样本中蛋白表达不足”。

　　7. 蛋白用量要适中

　　单次 Co‑IP 通常使用 500 μg–1 mg 总蛋白，具体需根据目标蛋白丰度和抗体效价调整。 蛋白量过低会导致信号弱;过高则可能增加非特异性结合和背景。

　　8. 样本避免反复冻融

　　裂解液z好现制现用。如需保存，应分装后置于 −80℃，避免反复冻融导致蛋白聚集、降解或复合物解离。

　　9. 必要时做预清除

　　正式 IP 前可用空白 Protein A/G 磁珠或琼脂糖珠预清除裂解液，去除易非特异性吸附珠子的杂蛋白，降低背景。 预清除不是所有体系都必须，但对背景较高的样本有帮助。

　　10. 盐浓度和去垢剂浓度需要平衡

　　孵育和洗涤体系中 NaCl 通常控制在 150–300 mM 左右;盐浓度过高可能破坏静电依赖的蛋白互作，过低则可能增加非特异性吸附。 洗涤强度应逐步优化：背景高时可适当提高盐浓度或去垢剂浓度;互作信号弱时则应降低洗涤强度。

　　三、对照设置建议

　　Input 对照：验证目标蛋白和互作蛋白在裂解液中存在。

　　IgG 同型对照：使用与 IP 抗体同种属、同亚型的非特异性 IgG，排除抗体或珠子非特异性结合。

　　空白珠子对照：不加抗体，仅用珠子孵育样本，评估珠子自身吸附。

　　反向 Co‑IP：互换诱饵蛋白和互作蛋白的抗体进行验证，提高结论可靠性。

       来源：网络