生物SEM测试细胞形貌流程是什么？有哪些常见坑？

　　生物SEM看细胞形貌，关键不在“上机拍”，而在固定、脱水、干燥、导电处理这四步。只要有一步没控好，图像里看到的很可能不是细胞真实形貌，而是制样伪影。

　　标准流程

　　1. 取材与清洗

　　贴壁细胞可先清洗去除培养基和血清，悬浮细胞离心收集沉淀。组织块尽量控制在 1–2 mm³，避免中心固定不透。

　　2. 化学固定

　　常用 2.5% 戊二醛(PBS 缓冲，pH 6.8–7.4)，4℃ 固定数小时至过夜。必要时用 1% 四氧化锇后固定，稳定脂质和膜结构。

　　3. 梯度脱水

　　乙醇梯度：30% → 50% → 70% → 80% → 90% → 95% → 100%，每步 10–15 分钟。100% 乙醇不宜浸泡过久，否则细胞易脆化。

　　4. 干燥(关键)

　　推荐临界点干燥(CPD)：用液态 CO₂ 置换乙醇，在临界点消除液-气界面张力，避免细胞塌陷。

　　替代方案：叔丁醇冷冻干燥，适合无 CPD 设备时。

　　5. 导电处理

　　离子溅射喷镀 5–10 nm 金、铂或金钯合金。若后续要做 EDS 元素分析，改用碳镀膜避免金属信号干扰。

　　6. 上机成像

　　加速电压建议 5–10 kV(降低荷电和电子束损伤)，工作距离 5–10 mm，二次电子(SE)模式观察表面形貌。

　　常见坑

　　塌陷变形——自然风干或跳过临界点干燥，表面张力把细胞"压扁"，微绒毛、伪足全没了。

　　荷电效应——喷金太薄或接地不良，图像出现亮斑、条纹、漂移。降低加速电压或重新喷厚一点可缓解。

　　固定不充分——细胞内部结构模糊、膜破裂。戊二醛浓度不够、pH 偏离或固定时间不足都会导致。

　　脱水梯度跳跃——直接从低浓度跳到 100% 乙醇，细胞剧烈收缩变形。

　　喷金过厚——超过 15–20 nm 会掩盖纳米级表面细节，微绒毛变粗、孔隙变小。

　　电子束损伤——高电压、大束流长时间照射同一区域，有机样品会分解变形。低电压 + 快扫 + 帧叠加是稳妥策略。

       来源：网络