流式细胞术实验步骤及注意事项

　　流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代先进的细胞定量分析技术。

　　流式周期实验步骤

　　1、收集细胞:弃去上清，加入1mlPBS清洗一次，弃上清，再加入1ml0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1500rpm离心5min收集细胞

　　2、PBS洗涤细胞:加入3ml4°C预冷的PBS完全重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清。沉淀震荡混匀。

　　3、固定过夜:沉淀中缓慢加入-20°C预冷的90%乙醇，重悬细胞，冰浴过夜。4、PBS洗涤细胞:加入2ml PBS混匀后，1500rpm离心5min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100ulPBS重悬细胞。

　　5、去除RNA:加入2ul浓度为1mg/ml的RNaseA(去离子水配制)，37°C水浴40min。

　　6、荧光标记:加入100ul浓度为100&micr o;g/ml的PI染色液(PBS配制),避光染色20min。

　　7、上机检测:流式细胞仪激发波长为488nm，用Cell Quest及Modfit软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。

　　流式凋亡实验步骤

　　1、收集上清:收集培养液于流式管中(有少量悬浮细胞)。

　　2、收集细胞:六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1ml0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，1500rpm离心5min，弃上清。

　　3、PBS洗涤细胞:加入3ml4°C预冷的PBS完全重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清。沉淀用300uL的BindingBuffer重悬。

　　4、荧光标记:加入5uL Annexin V-FITC匀后,加入5 pL Propidium lodide混匀。室温下避光反应5-15min。

　　5、于1hour内上机检测:Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。

　　流式细胞仪参数如下:激发波长Ex=488nm，发射波长Em=530nm。

       结果展示

       来源：网络