生物实验外包：冰冻切片免疫荧光实验步骤

　　1、冰冻切片固定:冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

　　2、抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中低火5min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复强度根据组织来确定)

　　3、BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

　　4、加一抗:轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

　　5、加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

　　6、DAPI复染细胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

　　7、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

　　8、镜检拍照:切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm;FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm;CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm)

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