微生物菌种库 TEM 外源污染检测标准流程

　　微生物菌种库(包含细菌种子批、主/工作细胞库)的质量控制是生物制品研发与生产的核心环节，外源污染检测直接关系产品安全性与合规性。透射电子显微镜(TEM)凭借纳米级分辨率与无偏倚检测优势，可直接观察样品中的病毒颗粒、支原体、杂菌等外源因子，是《中国药典》(2025版)、ICH Q5A(R2)明确规定的菌种库/细胞库外源污染检测核心方法。本流程严格遵循法规要求，结合检测实操经验制定，适用于各类微生物菌种库的常规检定与合规申报。

　　一、适用范围

　　本流程适用于生物制品生产用细菌种子批、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)、生产终末细胞(EOPC)的外源污染TEM检测，检测目标包括：病毒/病毒样颗粒、支原体、真菌、噬菌体、其他非目标微生物等。

　　二、样品接收与前处理

　　样品接收核查

　　接收时需确认样品信息完整性：包括菌种/细胞名称、来源、代次、活细胞数量(要求不低于1×10⁷个)、保存条件、运输时效。活细胞样品需全程2-8℃冷链运输，避免冻融;细菌菌种需确认培养物纯度，无明显杂菌污染痕迹。

　　样品前处理

　　细菌/真菌菌种：采用负染色法。取少量新鲜培养物用无菌水重悬，滴加在覆有碳支持膜的铜网上，用2%磷钨酸(pH7.0)染色1-2分钟，吸去多余染液，室温干燥后待检。

　　哺乳动物细胞：采用超薄切片法。取1×10⁷个活细胞，用2.5%戊二醛4℃固定2小时以上，锇酸后固定1小时，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，用超薄切片机切取70-90nm厚度的切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色后待检。

　　三、TEM检测操作

　　设备参数设置

　　使用透射电子显微镜，加速电压80-120kV，根据样品类型调整放大倍数：菌种负染样品先低倍(5000×)定位目标区域，再切换至20000-50000×观察形态细节;细胞超薄切片先低倍(3000×)观察细胞整体结构，再切换至10000-30000×检查亚细胞结构。

　　观察要求

　　细菌菌种：至少观察10个不同视野，确认菌体形态是否符合目标菌特征(如大肠埃希菌的杆状形态、细胞壁结构)，检查是否存在噬菌体颗粒、支原体(无细胞壁、多形性微小颗粒)、真菌孢子等外源污染物。

　　细胞样品：至少检查200个完整的中位细胞切面(含细胞核的切面)，逐一观察细胞核、线粒体、高尔基体、细胞膜等结构的完整性，重点检查细胞内、细胞膜表面是否存在病毒样颗粒(记录颗粒的形态、大小、有无包膜、分布位置)，同时排查支原体(多附着在细胞膜表面)、细菌、真菌等污染物。

　　四、结果判定

　　合格标准

　　细菌种子批：仅观察到目标菌的典型形态特征，无噬菌体、支原体、真菌等其他微生物或病毒样颗粒。

　　细胞库：200个受检细胞中，细胞形态结构正常，未发现外源病毒颗粒、支原体、细菌、真菌等任何外源污染物。

　　阳性结果处理

　　若发现疑似外源污染物，需重新取样复检，同时结合PCR、培养法等分子/微生物学方法进一步确认污染类型;若确认为外源污染，该批次菌种库判定为不合格，不得用于后续生产。

　　五、方法学验证与质控要求

　　方法学验证

　　按照ICH Q2(R1)要求完成方法验证，核心指标包括：专属性(可明确区分目标微生物与外源污染物)、灵敏度(可检测到20nm以上的病毒样颗粒)、重复性(同一操作人员、不同批次样品的检测结果一致性≥95%)。

　　日常质控

　　每批次检测必须设置阳性对照(已知含病毒样颗粒的样品)和阴性对照(无菌/无污染的空白样品)，确保检测系统有效性。

　　检测人员需具备微生物学、电镜操作相关资质，每年至少参加1次外部能力验证。

　　TEM设备每6个月完成1次校准，每次使用前完成光路对中、像散校正等常规维护。

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