细胞实验外包：细胞热位移测定工作原理及实验流程

　　细胞热位移测定(Cellular Thermal Shift Assay, CETSA)是一项革命性的生物物理技术，专门用于在活细胞或组织等天然生理环境中，直接验证药物与靶点蛋白是否发生了真实的结合(即靶点结合，Target Engagement)。

　　与传统的体外结合实验不同，CETSA z大的突破在于它打破了纯化蛋白脱离生理环境的局限，能够z大程度地保留细胞内的复杂微环境，从而真实反映药物在体内的作用机制。

　　工作原理

　　CETSA 的核心机制基于一个非常直观的现象：配体结合会改变蛋白质的热稳定性。

　　热变性基础： 在正常的生理温度下，蛋白质维持着其天然的折叠构象。当温度升高时，蛋白质会发生热变性、结构展开，进而相互聚集并沉淀。

　　结合带来稳定： 当靶点蛋白与特异性配体(如小分子药物、多肽等)结合后，其构象稳定性会显著提升，抵抗热变性的能力增强。

　　热位移现象： 这种稳定性的提升在宏观上表现为蛋白质的热变性温度(Tm值)向高温方向发生偏移(即 ΔTm)。结合亲和力越强，温度偏移量通常越大。通过对比药物处理组和对照组的热位移曲线，就能定量评估药物与靶点在活细胞内的结合情况。

　　实验流程

　　CETSA 的实验流程主要分为两大经典模式：温度梯度模式(Melting Curve)和等温剂量响应模式(ITDRF CETSA)。

　　1. 温度梯度模式(Melting Curve)

　　药物孵育： 将细胞或组织样本分为药物处理组和溶剂对照组(如DMSO)，在生理条件(如37℃)下孵育，确保药物充分穿透细胞膜并与靶点结合。

　　梯度加热： 将处理后的样本分装，设置一系列温度梯度(通常在37℃-80℃之间，间隔3-5℃)进行短暂加热，使未结合药物的靶点蛋白发生热变性沉淀。

　　分离与检测： 加热后迅速冰浴冷却，裂解细胞并高速离心，分离出上清液(可溶性蛋白)和沉淀(变性蛋白)。随后利用 Western Blot、质谱或荧光定量等方法检测上清液中靶点蛋白的含量，绘制热位移曲线。

　　2. 等温剂量响应模式(ITDRF CETSA)

　　与温度梯度模式不同，此模式在单一恒定温度下进行加热。

　　设置一系列不同浓度的药物处理样本，通过检测可溶性靶点蛋白含量随药物浓度的变化，来验证结合的特异性与饱和性，并计算 EC50 值。

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