流式细胞术检测细胞周期：PI染色法

　　流式细胞术结合碘化丙啶(PI)染色是分析细胞周期的经典方法。其核心原理是利用PI染料嵌入双链DNA，其荧光强度与DNA含量成正比，从而区分处于不同周期时相(G0/G1期、S期、G2/M期)的细胞。

　　实验原理

　　PI是一种核酸染料，不能穿透完整的细胞膜。因此，实验前必须使用乙醇等试剂对细胞进行固定和透化，使PI能够进入细胞核与DNA结合。由于细胞在周期各时相的DNA含量不同：

　　G0/G1期：具有二倍体DNA含量 (2N)。

　　G2/M期：具有四倍体DNA含量 (4N)。

　　S期：DNA含量介于2N和4N之间。

　　通过流式细胞仪检测PI的荧光强度，可以绘制出DNA含量分布图，并利用软件(如ModFit, FlowJo)分析各时相细胞的百分比。

　　操作流程

　　细胞收集与固定

　　细胞收集：收集待测细胞(建议细胞数 > 1×10⁶个)。对于贴壁细胞，使用不含EDTA的胰酶消化，并用含血清的培养基中和，将所有细胞(包括悬浮细胞)收集到离心管中。

　　洗涤：4℃, 300-500g离心5分钟，弃上清。用预冷的PBS重悬细胞并洗涤一次，再次离心弃上清，尽量去除残留的培养基和胰酶。

　　固定：这是关键步骤。用1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，然后在涡旋状态下，逐滴加入3mL预冷的70%乙醇(终浓度约70%)。

　　固定保存：将细胞悬液置于4℃固定至少4小时，或-20℃过夜固定(效果更佳，可保存数周)。

　　PI染色

　　洗涤去乙醇：4℃, 500g离心5分钟，小心弃去上清(乙醇)。用预冷的PBS重悬细胞，洗涤两次，彻底去除乙醇，以免影响染色效果。

　　配制染色液：使用含 RNase A 的PI染色液。RNase A可以降解RNA，防止PI与RNA结合产生背景信号，确保检测的荧光仅来自DNA。

　　推荐配方：50 µg/mL PI + 20-100 µg/mL RNase A，溶于PBS。

　　注意：许多商业化的PI染色液为即用型，已包含RNase A。

　　染色：每管加入200-500 µL配制好的染色液，充分重悬细胞。

　　孵育：在37℃避光孵育30分钟，或在室温避光孵育30-60分钟。

　　上机检测与数据分析

　　过滤：上机前，用300-400目的细胞筛网过滤细胞悬液，去除细胞团块，防止堵塞仪器。

　　流式检测：使用流式细胞仪检测，PI由488nm激光激发，发射荧光波长为615-630nm(通常使用FL2或FL3通道)。

　　数据分析：

　　首先，通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)设门，排除细胞碎片和粘连体。

　　然后，分析PI荧光信号(通常为FL2-A或FL3-A)的直方图。

　　使用专业软件(如ModFit LT, FlowJo)对DNA含量峰图进行拟合，计算G0/G1期、S期和G2/M期细胞的百分比。

       来源：网络