EdU细胞增殖检测实验流程步骤

　　EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)检测是目前细胞增殖研究中主流、高效的方法之一。相比传统的BrdU检测，它不需要DNA变性(酸处理或酶消化)，操作更简单，且对细胞形态保护更好。

　　EdU是一种胸苷类似物，能在细胞增殖的S期(DNA合成期)被掺入到新合成的DNA中。通过“点击化学”反应(Click Chemistry)，荧光标记的叠氮化物能特异性地与EdU结合，从而在荧光显微镜或流式细胞仪下被检测到。

　　操作步骤

　　1. 细胞接种与处理

　　接种：取对数生长期的细胞，消化计数后接种到培养板中。

　　密度建议：96孔板通常接种 2,000~10,000个细胞/孔(约100μL体系)，具体视细胞大小和生长速度而定。

　　贴壁：放入37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁并生长至合适密度(通常60%-80%)。

　　加药处理：根据实验目的，加入药物或刺激因子处理细胞。

　　2. EdU 标记(关键步骤)

　　配制工作液：用完全培养基将EdU储备液稀释至 2×工作浓度(通常终浓度为 10 μM)。

　　注意：EdU浓度和孵育时间需根据细胞类型优化。对于大多数肿瘤细胞，10 μM孵育2小时是标准条件。

　　加样孵育：

　　若孔内原有100μL培养基，直接加入100μL的2×EdU工作液，使终浓度为10μM。

　　放入培养箱继续孵育 2小时。

　　3. 细胞固定与通透

　　洗涤：吸去含EdU的培养基，用PBS轻柔洗涤细胞2次，每次3分钟。

　　固定：每孔加入50-100μL 4%多聚甲醛，室温固定 15-30分钟。

　　目的：保持细胞形态。

　　洗涤：吸去固定液，用PBS洗涤3次，每次3-5分钟。

　　通透：每孔加入100μL 0.5% Triton X-100(溶于PBS)，室温孵育 10-20分钟。

　　目的：增加细胞膜通透性，让点击化学反应试剂进入细胞核。

　　洗涤：吸去通透液，用PBS洗涤2次。

　　4. Click 反应(染色)

　　配制反应液：严格按照试剂盒说明书，依次混合缓冲液、CuSO₄、荧光叠氮化物(如Alexa Fluor 488/555/594 Azide)和添加剂。

　　注意：反应液需现配现用，且配制后应在15分钟内使用。

　　孵育：每孔加入50-100μL反应液，确保覆盖细胞。

　　避光反应：室温避光孵育 30分钟。

　　5. 核染与观察

　　洗涤：吸去反应液，用含3% BSA的PBS或普通PBS洗涤3次，去除未反应的染料。

　　核染：加入Hoechst 33342或DAPI染液，室温避光孵育 5-10分钟。

　　z终洗涤：PBS洗涤3次。

　　成像：加入适量PBS或抗荧光淬灭封片剂，立即在荧光显微镜下观察并拍照。

       来源：网络