哪些情况不适合使用SPR技术？

　　虽然表面等离子体共振(SPR)是研究生物分子相互作用的“金标准”技术，具有免标记、实时、定量动力学等显著优势，但它并非万能，在以下情况下不适用或需谨慎使用：

　　1. 分子量过小(<100–200 Da)

　　问题：SPR 信号与结合分子的质量成正比。小分子(如药物化合物、代谢物、肽段 <5 个氨基酸)引起的折射率变化极微弱，信号常被噪声淹没。

　　典型表现：

　　RU 变化 <1–5 RU(接近仪器检测下限)

　　动力学拟合不可靠

　　替代方案：

　　竞争法 SPR(Solution Competition)：固定大分子配体，预混小分子与大分子分析物

　　BLI(生物膜干涉)：对小分子略敏感

　　ITC(等温滴定量热法)：直接测热力学参数

　　NMR / MST(微量热泳动)

　　经验法则：

　　小分子直接检测 KD 通常需 >10 μM;若 KD <1 μM，建议用竞争法。

　　2. 样品纯度低或含杂质

　　问题：SPR 对非特异性结合极其敏感。细胞裂解液、血清、粗提蛋白中的杂质会：

　　造成高背景信号

　　非特异吸附到芯片表面

　　掩盖真实互作信号

　　要求：

　　蛋白纯度 >95%(SDS-PAGE 或 SEC 验证)

　　无聚集(DLS 或 SEC-MALS 确认单分散)

　　例外：某些高亲和力抗体可直接检测 hybridoma 上清(但需严格对照)

　　注意：即使 5% 杂质也可能导致假阳性!

　　3. 存在严重的传质限制(Mass Transport Limitation, MTL)

　　问题：当结合速率极快(kon >10⁶ M⁻¹s⁻¹)或配体固定密度过高时，分析物从溶液扩散到芯片表面的速度 慢于实际结合速度，导致：

　　测得的 kon 被低估

　　解离曲线异常(看似“慢解离”)

　　识别方法：

　　改变流速(如 10 → 100 μL/min)，若 kon 显著变化 → 存在 MTL

　　解决方案：

　　降低配体固定量(<50 RU)

　　提高流速

　　使用低密度芯片

　　4. 多价/多聚体相互作用

　　问题：若分析物或配体为多聚体(如 IgM 抗体、受体簇)，会出现：

　　avidity 效应(表观亲和力远高于真实 KD)

　　解离极慢(koff ≈ 0)

　　无法用 1:1 模型拟合

　　示例：

　　固定抗原，流过 IgG → 正常

　　固定抗原，流过 IgM → 强 avidity，KD 假性 pM 级

　　对策：

　　使用单价 Fab 片段

　　采用竞争抑制实验间接测定

　　5. 需要检测构象变化或弱瞬时相互作用

　　问题：SPR 仅检测质量变化，无法报告：

　　蛋白构象改变(如变构激活)

　　无质量变化的相互作用(如某些酶-底物复合物)

　　极弱且瞬时的结合(koff >10 s⁻¹，信号来不及响应)

　　替代技术：

　　FRET / BRET：检测分子距离变化

　　HDX-MS(氢氘交换质谱)：探测构象动态

　　NMR：原子级分辨率互作信息

　　6. 样品稳定性差

　　问题：SPR 实验通常持续数小时。若蛋白在缓冲液中易降解、聚集或失活：

　　信号漂移

　　再生后活性丧失

　　数据重复性差

　　缓解措施：

　　添加稳定剂(甘油、BSA、还原剂)

　　低温运行(4–15°C)

　　缩短实验时间(减少浓度点)

　　7. 缺乏合适的固定策略

　　问题：若两个蛋白均无标签、疏水性强、或关键结合域靠近固定端，可能导致：

　　固定后失活

　　结合位点被遮蔽

　　非定向随机偶联

　　解决方案有限：

　　尝试不同芯片(CM5 共价 vs NTA 定向)

　　生物素化后用 SA 芯片

　　若均失败，改用 BLI(可直接吸附)或 Co-IP

       来源：网络