抗原抗体亲和力怎么测

　　抗原-抗体亲和力(Affinity)的测定是抗体工程、诊断试剂开发、疫苗评价和生物药质量控制的核心环节。亲和力通常用平衡解离常数(KD)表示，KD 越小，亲和力越高(如 nM 级为高亲和力)。

　　方法详解

　　1. SPR(Surface Plasmon Resonance)

　　原理：抗原固定在芯片上 → 抗体流过 → 实时监测结合/解离

　　优势：

　　无标记、实时、可测 kon/koff

　　FDA/EMA 接受用于 IND 申报

　　典型结果：

　　KD = 2.5 nM, kon = 1.2×10⁶ M⁻¹s⁻¹, koff = 3.0×10⁻³ s⁻¹

　　适用：单抗表征、FcRn 结合(半衰期预测)、表位 binning

　　2. BLI(Bio-Layer Interferometry)

　　原理：抗体捕获在传感器上 → 浸入抗原溶液 → 光学干涉测结合

　　优势：

　　无需微流控，操作简便

　　样品消耗少(10–200 μL)

　　常用传感器：Protein A / G(直接捕获 IgG)

　　适用：中低通量抗体筛选、稳定性评估

　　3. ELISA(竞争法或直接法)

　　原理(竞争 ELISA 测 KD)：

　　固定抗原

　　加入系列稀释的未标记抗体 + 固定浓度酶标抗体

　　信号抑制率 → 拟合 IC₅₀ → 换算 KD

　　优势：成本低、高通量、实验室普及

　　局限：仅得 KD，无法区分 kon/koff

　　4. 流式细胞术(FACS)

　　适用场景：细胞表面抗原(如 CD 分子、受体)

　　方法：

　　荧光标记抗体梯度染色细胞

　　测 MFI(平均荧光强度)→ Scatchard plot → KD

　　注意：需校正非特异结合，抗原表达量影响结果

       来源：网络