蛋白质多糖相互作用实验方法

　　蛋白质-多糖相互作用在免疫识别、细胞信号传导、病原体感染、食品质构、药物递送等领域具有核心作用。这类相互作用通常弱、动态、依赖结构，测定难度高于蛋白-小分子或蛋白-蛋白相互作用。

　　1. 表面等离子体共振(SPR)

　　固定策略(关键!)

　　优化建议

　　运行缓冲液：加 1–5 mM Ca²⁺/Mn²⁺(许多 lectin 依赖金属离子);

　　再生条件：温和(如 10–50 mM EDTA 或 0.5 M NaCl)，避免破坏蛋白;

　　数据解读：若解离极慢，可能为多价结合，需用bivalent model拟合。

　　适用：肝素-抗凝血酶、透明质酸-CD44、病原体 lectin-宿主糖链。

　　2. 等温滴定量热法(ITC)

　　优势：直接测结合热，得 KDKD​ 、ΔH、ΔS、化学计量比(n);

　　挑战：

　　多糖溶解度低(需超声/加热助溶);

　　结合热信号弱(因 ΔH 小);

　　高浓度多糖易粘度干扰。

　　技巧：

　　使用 低分子量寡糖(如 DP4–DP8)代替高聚物;

　　增加注射次数(>20 次)提高信噪比。

　　3. 凝集素微阵列(Lectin Array)或 糖芯片(Glycan Array)

　　原理：将数百种糖结构固定在芯片上，孵育荧光标记蛋白，扫描结合信号;

　　平台：CFG(Consortium for Functional Glycomics)、RayBiotech;

　　优点：高通量筛选糖特异性(如识别 Galβ1-4GlcNAc vs. Galα1-3Gal);

　　局限：需荧光标记蛋白;不能得动力学参数。

　　经典应用：流感病毒 HA 蛋白识别 α2,6- vs α2,3-唾液酸。

　　4. 亲和电泳(Affinity Electrophoresis)

　　原理：在凝胶中加入多糖，蛋白迁移率因结合而降低;

　　类型：

　　Native PAGE + 多糖：定性;

　　Frontal Analysis CE：定量 KDKD​ 。

　　优点：无需标记，成本低;

　　适用：初步验证结合(如壳聚糖-溶菌酶)。

　　5. 核磁共振(NMR)

　　方法：

　　STD-NMR(Saturation Transfer Difference)：鉴定多糖中与蛋白接触的糖环质子;

　　Chemical Shift Perturbation：观察蛋白信号位移。

　　要求：

　　蛋白 < 30 kDa;

　　同位素标记(¹⁵N/¹³C)更佳。

　　优势：原子级分辨率，无需固定。

　　6. 微量热泳动(MST)

　　操作：

　　荧光标记蛋白(或 intrinsic Trp);

　　滴定多糖溶液(0.1 nM – 10 mM);

　　优点：样品量少(4 μL)，可在缓冲液/血清中测试;

　　注意：多糖高粘度可能影响热泳信号 → 需做粘度对照。

　　7. 功能与细胞水平验证

       来源：网络