细胞免疫荧光染色操作流程

　　细胞免疫荧光染色(Immunofluorescence Staining, IF)是一种利用荧光标记抗体特异性识别细胞内/表面靶蛋白，并通过荧光显微镜可视化其定位、表达水平及共定位的高灵敏度技术。广泛应用于细胞生物学、神经科学、肿瘤研究及感染免疫等领域。

　　步骤1：细胞培养与处理

　　将细胞接种于多聚赖氨酸/明胶包被的盖玻片上(增强贴附);

　　待细胞达 60–80% 汇合度时进行刺激/药物处理。

　　步骤2：固定(Fixation)

　　弃培养基，PBS轻洗1次;

　　加 4% PFA(室温，15 min);

　　PBS洗3×5 min。

　　注意：

　　避免过度固定(>30 min 导致抗原掩蔽);

　　磷酸化蛋白建议用 冷甲醇(–20°C, 10 min) 固定，更好保留表位。

　　步骤3：通透(Permeabilization)

　　加 0.3% Triton X-100 in PBS(室温，10 min);

　　PBS洗3×5 min。

　　膜蛋白/表面蛋白：跳过通透步骤，仅固定即可。

　　步骤4：封闭(Blocking)

　　加 5% BSA in PBS(室温，1 h);

　　勿洗，直接加一抗。

　　步骤5：一抗孵育

　　一抗用封闭液稀释;

　　4°C 孵育过夜(或室温 1–2 h);

　　PBS洗3×10 min(彻底去除非结合抗体)。

　　步骤6：荧光二抗孵育

　　二抗用封闭液稀释，避光;

　　室温避光孵育 1 h;

　　PBS洗3×10 min(避光操作)。

　　步骤7：核染与封片

　　DAPI(1 μg/mL in PBS)染核 5 min;

　　PBS洗2×5 min;

　　将盖玻片细胞面朝下封于载玻片，用抗淬灭封片剂;

　　4°C 避光固化(ProLong需固化过夜)。

       来源：网络