药物与蛋白相互作用实验方法

　　药物与蛋白相互作用实验是药物发现、靶点验证、机制研究和安全性评价的核心环节。其目标是确认药物是否能特异性、可逆地结合靶标蛋白，并评估结合的亲和力、动力学、热力学及功能后果。

　　1. 表面等离子体共振(SPR)

　　原理：药物流过固定化蛋白芯片，实时监测结合/解离。

　　输出： kaka​ (结合速率)、 kdkd​ (解离速率)、 KD=kd/kaKD​=kd​/ka​ 。

　　优点：

　　免标记、实时、高灵敏度(pM–μM);

　　可区分快结合/慢解离(长效药物关键)。

　　适用：小分子、肽、抗体药物。

　　注意：需确保蛋白活性;小分子需高载量芯片(如 CM5 高密度偶联)。

　　金标准：FDA 申报常要求 SPR 数据。

　　2. 等温滴定量热法(ITC)

　　原理：测量药物滴定蛋白时的热释放/吸收。

　　输出： KDKD​ 、ΔH(焓变)、ΔS(熵变)、化学计量比(n)。

　　优点：

　　唯一无需固定或标记的方法;

　　揭示结合驱动力(氢键 vs 疏水作用)。

　　局限：样品消耗大(>100 μM)， KDKD​ 范围 1 nM – 100 μM z佳。

　　适用：验证 SPR 结果，指导结构优化。

　　3. 微量热泳动(MST)

　　原理：分子在红外激光加热区迁移行为随结合改变。

　　优点：

　　样品极微量(4 μL，低至 10 pM);

　　可在细胞裂解液、血清中测试(近生理环境)。

　　要求：药物或蛋白需荧光标记(或 intrinsic Trp 荧光)。

　　适用：膜蛋白、难纯化靶点、快速验证。

　　4. 荧光偏振(FP)

　　原理：荧光标记药物旋转快(低偏振);结合蛋白后旋转变慢(高偏振)。

　　优点：均相、高通量(384 孔板)、快速。

　　局限：需标记药物(可能影响活性);仅适用于小分子 vs 大分子。

　　适用：激酶、核受体、GPCR 配体初筛。

　　5. 热稳定性 shift 实验(CETSA / DSF)

　　原理：药物结合使蛋白热稳定性提高 → 熔解温度(Tm)升高。

　　方法：

　　DSF(差示扫描荧光)：SYPRO Orange 染料检测;

　　CETSA(细胞热 shift)：在细胞或组织中验证靶点 engagement。

　　优点：可在细胞内验证药物是否结合靶点。

　　适用：靶点验证、脱靶效应初筛。

　　6. Pull-down + 质谱(Affinity Purification-MS)

　　原理：药物偶联到树脂 → 捕获细胞裂解液中结合蛋白 → MS 鉴定。

　　优点：无偏见发现所有结合蛋白(包括脱靶)。

　　关键：需设计阴性对照(如 inactive analog)。

　　适用：MoA 研究、毒性机制解析。

　　7. 功能活性测定(Functional Assay)

　　结合 ≠ 抑制!必须验证功能后果。

　　酶抑制实验：如激酶 IC₅₀ 测定;

　　细胞报告基因：如核受体转录激活;

　　结合竞争实验：用已知配体验证结合位点。

       来源：网络