抗体亲和力检测方法有哪些？

　　抗体亲和力(Affinity)是指单个抗原结合位点与抗体 Fab 段之间的结合强度，通常用平衡解离常数(KD)表示。KD 值越小(如 pM–nM 级)，亲和力越高。下面是目前主流的抗体亲和力检测方法，按原理、灵敏度、通量和应用场景分类：

　　一、表面等离子共振(SPR)—— 金标准方法

　　原理

　　将抗原固定在传感器芯片表面，抗体流过时发生结合，引起折射率变化(以响应单位 RU 表示)，实时监测结合/解离过程。

　　输出参数

　　ka(结合速率常数，M⁻¹s⁻¹)

　　kd(解离速率常数，s⁻¹)

　　KD = kd / ka(平衡解离常数，M)

　　优点

　　无需标记(label-free)

　　实时动力学数据(可区分快结合/慢解离 vs. 慢结合/快解离)

　　高灵敏度(可达 pM 级)

　　缺点

　　仪器昂贵(如 Biacore™, Reichert, Nicoya)

　　抗原需固定，可能影响构象

　　需优化固定条件(避免非特异吸附)

　　应用

　　抗体药物候选分子筛选(如 ADC、双抗)

　　表位 binning(结合竞争分析)

　　二、生物膜干涉技术(BLI)—— 高通量替代 SPR

　　原理

　　将抗原或抗体固定在光纤生物传感器 tip 上，结合导致光干涉图谱 shift，实时监测结合信号。

　　代表平台

　　FortéBio Octet®(Sartorius)

　　支持 96 或 384 孔板格式

　　优点

　　无需微流控，操作简便

　　高通量(一次运行测数十个样品)

　　样品消耗少(~50–200 µL)

　　缺点

　　灵敏度略低于 SPR

　　质量传递效应(mass transport limitation)可能影响动力学准确性

　　应用

　　抗体滴度与亲和力初筛

　　Fc 受体结合、血清稳定性测试

　　三、酶联免疫吸附试验(ELISA)—— 间接法估算 KD

　　原理

　　通过饱和结合曲线拟合估算亲和力：

　　固定抗原浓度，梯度稀释抗体;

　　测 OD 值，绘制结合曲线;

　　用 Scatchard plot 或非线性回归拟合 KD。

　　优点

　　设备普及(酶标仪即可)

　　成本低，适合实验室常规检测

　　缺点

　　非实时，仅得表观 KD(受洗涤步骤影响)

　　无法获得动力学参数(ka/kd)

　　易受非特异结合干扰

　　改进方法

　　Solution Competition ELISA：更接近真实 KD

　　Homogeneous ELISA(如 AlphaLISA)：减少洗涤误差

　　四、等温滴定量热法(ITC)—— 直接测热力学参数

　　原理

　　将抗体逐滴加入抗原溶液，测量结合释放/吸收的热量，直接计算：

　　KD

　　ΔH(焓变)

　　ΔS(熵变)

　　化学计量比(n)

　　优点

　　无需固定或标记

　　提供完整热力学信息

　　适用于弱相互作用(KD = µM–mM)

　　缺点

　　样品消耗大(mg 级)

　　灵敏度较低(难测 nM 以下 KD)

　　实验时间长(>1 小时/样本)

　　应用

　　机制研究(如氢键 vs. 疏水作用主导)

　　小分子-抗体相互作用

　　五、流式细胞术(Flow Cytometry)—— 细胞表面抗原结合

　　原理

　　用荧光标记抗体染色表达抗原的细胞，通过中值荧光强度(MFI)与抗体浓度关系拟合 KD。

　　优点

　　在天然膜环境中检测(构象更真实)

　　可区分活/死细胞

　　缺点

　　抗原表达量需均一

　　荧光淬灭/内化影响准确性

　　数据分析复杂

　　应用

　　CAR-T 靶点亲和力验证

　　全细胞水平抗体筛选

       来源：网络