远紫外圆二色谱 （cd）光谱测试流程与步骤

　　远紫外圆二色谱(Far-UV Circular Dichroism, CD)光谱是一种快速、无损、溶液相的生物大分子二级结构分析技术，特别适用于蛋白质、多肽、核酸等手性分子的构象研究。其核心原理是：手性分子对左旋和右旋圆偏振光的吸收不同，产生差分吸收信号(ΔA = Aₗ – Aᵣ)，该信号与分子二级结构高度相关。

　　什么是圆二色性?

　　当圆偏振光通过手性物质(如蛋白质的α-螺旋)时，由于左手和右手圆偏振光被吸收的程度不同，合成后的电矢量会变成一个椭圆偏振光。这种差异(椭圆度)就是圆二色性。

　　为什么远紫外区(180-250 nm)是关键?

　　在这个波段，光主要被蛋白质的肽键吸收。而肽键的电子跃迁对周围环境极其敏感。不同的规则二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲)会形成不同的手性环境，从而产生特征性的CD光谱。

　　测试流程与关键步骤

　　样品准备(关键!)

　　纯度：样品必须高纯度，避免其他手性分子(如DNA、辅因子)或杂质干扰。

　　缓冲液：

　　使用低吸光度的缓冲液。避免使用高浓度的氯离子(Cl⁻)、磷酸根(PO₄³⁻)、三(羟甲基)氨基甲烷等，它们在远紫外区有强吸收。

　　推荐缓冲液：10-20 mM 磷酸钾(pH 7.0-7.4)、氟化物盐、硼酸盐。如需稳定蛋白，可加少量硫酸盐。

　　浓度：

　　需精确测定(建议用紫外分光光度法，基于芳香族氨基酸吸收)。

　　典型浓度范围：0.1 - 0.5 mg/mL(取决于光程)。

　　体积：根据样品池光程而定(常用0.1 cm或0.02 cm光程池)，通常需要150-400 μL。

　　仪器设置与参数优化

　　波长范围：通常设定为 190-260 nm 或 180-260 nm(取决于仪器和缓冲液)。

　　扫描速度：中等速度(如50-100 nm/min)，过快会降低信噪比和数据分辨率。

　　带宽：通常1 nm。

　　响应时间：0.5-2秒，与扫描速度匹配。

　　累加次数：为提高信噪比，通常扫描累加3-5次后取平均。

　　温度控制：使用带温控的样品池夹套，保持恒定温度(如25°C)。

　　测试步骤

　　基线校正：用纯缓冲液(与样品缓冲液完全相同)装入样品池，扫描得到基线光谱。

　　样品测试：用样品溶液(蛋白溶于缓冲液)替换缓冲液，在完全相同条件下扫描。

　　数据处理：软件自动将样品光谱减去基线光谱，得到校正后的蛋白质CD光谱。

       来源：网络