氨基酸的测定方法

　　经过前处理得到的游离氨基酸混合液，需要通过以下方法进行分离和检测。由于氨基酸本身缺乏紫外/荧光特性或挥发性，通常需要衍生化处理。

　　方法一：柱后衍生法 —— 氨基酸自动分析仪

　　这是经典、专用的方法。

　　原理：

　　分离：样品注入离子交换色谱柱。

　　洗脱：通过改变缓冲液的pH和离子强度，将不同氨基酸依次洗脱。

　　柱后衍生：从柱子流出的氨基酸与衍生试剂(如茚三酮、邻苯二甲醛)混合反应。

　　检测：衍生后的产物用可见光或荧光检测器检测(茚三酮产物在570nm检测)。

　　优点：自动化程度高，定量准确，重现性好。

　　缺点：分析时间较长(通常>60分钟)，灵敏度相对较低。

　　方法二：柱前衍生法 —— 高效液相色谱法

　　这是目前应用广泛、灵活的方法。

　　原理：

　　柱前衍生：将氨基酸混合液与衍生化试剂反应，生成具有强紫外吸收或荧光的衍生物。

　　分离与检测：衍生物在反相C18色谱柱上被分离，然后用紫外或荧光检测器检测。

　　常用衍生化试剂：

　　邻苯二甲醛：与一级胺(除脯氨酸、半胱氨酸)反应生成强荧光产物。快速但不稳定。

　　异硫氰酸苯酯：生成在UV 254nm有强吸收的衍生物。稳定性好，是Edman降解法测序的试剂。

　　氯甲酸芐酯：生成在UV 254nm有强吸收的稳定衍生物。

　　ACCQ-Fluor：专为氨基酸分析设计，试剂稳定，产物荧光强，灵敏度高。

　　优点：高灵敏度、高分辨率、分析速度快(通常20-30分钟)。

　　缺点：衍生步骤需要精确控制，否则影响重现性。

　　方法三：气相色谱-质谱法 / 液相色谱-质谱法

　　这是高端、灵敏的方法。

　　GC-MS：

　　流程：将氨基酸衍生化为易挥发的衍生物(如酯化、硅烷化)，然后用GC分离，MS检测。

　　优点：灵敏度极高，能提供确证性的结构信息。

　　缺点：衍生化步骤繁琐。

　　LC-MS/MS：

　　流程：通常也需柱前衍生，或直接使用亲水相互作用色谱(HILIC)柱分离，然后用质谱检测。

　　优点：无需衍生或简化衍生、超高灵敏度和特异性，可同时分析数十种氨基酸。

　　缺点：仪器非常昂贵，操作和维护复杂。

       来源：网络