扫描电镜生物样本制备常用干燥方法

　　扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。铄思百检测可提供生物样品干燥制样+SEM拍摄。

　　生物样品拍扫描电镜(SEM)样品干燥的方法很多,来介绍三种干燥方法主要有：空气干燥法、临界点干燥法、冰冻干燥。这些方法各有利弊,且适用样品种类不同。因此根据生物样品的特性选择一种适宜的干燥方法十分重要。

　　下述干燥方法各有优缺点，且适合于不同的生物样品种类。一般认为目前在用的z好的干燥方法是临界点干燥法，其次是冷冻干燥法、真空干燥法和自然干燥法虽然干燥方法在不断改进但还是只能把由干燥引起的样品变形控制在一定的范围内。临界点干燥法被认为是一种理想的干燥方法但仍存在大约5%的变形

　　干燥方法优缺点

　　空气干燥优点： 简便易行、节省时间

　　缺点：由于脱水剂挥发时表面张力的作用，组织块会产生收缩变形

　　临界点干燥优点： 较好地保存样品的微细结构;操作较方便， 快速2～3小时即可完成，常用

　　缺点：需要特殊仪器设备---临界点干燥仪。

　　含水样品直接冷冻干燥优点：无需脱水，不会使样品收缩，较早使用的方法

　　缺点：花费时间长，消耗液氮多，易产生冰晶损伤，未被广泛应用。

　　样品脱水后冷冻干燥优点： 可减少冰晶损伤，且干燥时间短

　　缺点：有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。

　　1.空气干燥法

　　自然干燥法是指样品中的水分在大气中自然蒸发或样品经脱水处理后脱水剂自然挥发而干燥的方法。样品从含脱水剂状态下进行自然干燥与样品从含水状态下进行自然干燥相比,由于脱水剂的表面张力系数小于水所以前者样品变形较小山。自然干燥法对于含水量较多的动植物组织、游离细胞等的干燥是不适用的因为杆燥过程中表面张力将使样品变形。自然干燥法对干种子、果壳某些干花粉、长期保存的昆虫针插标本和70%乙醇浸泡的昆虫标本以及蛋壳和蛋膜等样品是一个简易实用有效的方法虽然在自然干燥过程中样品体积有所收缩但却保留了样品的基本形态。

　　基本描述：将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥 ，也可直接(不脱水)放在干燥器中干燥。

　　常用方法

　　方法1：单固定或双固定→脱水→样品置于100%的脱水剂中→在空气中自然干燥;

　　方法2：固定→(组织导电处理)→浸泡在缓冲液与乙醚的1：1中5min→空气干燥;

　　方法3：单固定或双固定→乙醇脱水→浸没于六甲基二硅胺烷HMDS中二次每次15min→通风厨干燥1h

　　2.烘干干燥法

　　此方法将要研究的样品用烘干箱烘干，般温度控制在80C以下烘干程度以含水量在5%以下为好。此方法的干燥速度较快但水分蒸发时可能造成样品变形或微小断裂。适用于不易变形且耐热的样品,比如淀粉粒孢子粉等。

　　3.临界点干燥法

　　此方法是根据物质处在临界点时的特殊物理状态设计的一种干燥方法。在临界状态下液体和气体的密度相等气液界面完全消失液体的表面张力系数为零。临界点干燥法之所以一直被视为制作生物医学扫描样品可靠的干燥方法是因为此法能消除液体表面张力的作用干燥出的样品能z大程度地保存其自然形态”。临界点干燥法适合多种生物样品的干燥。

　　1.基本含义：临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。

　　2.基本概念：临界点：物质的气态和液态两相之间达到相同密度、成为均一流体时的温度和压力的总称。此时的温度称为临界点温度，压力称为临 界点压力。

　　3.中间剂：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。

　　4.常用干燥剂

　　co2，F-13，F-23，F-116，N2O

　　5.常用中间剂：

　　中间剂：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。

　　试剂：乙醇、丙酮

　　6.干燥过程：固定脱水→转入中间液→移至样品室→用液体CO2置换乙醇 →CO2汽化排气→干燥

　　7.临界点干燥失败(不彻底)的原因：

　　(1) 脱水不彻底

　　(2) 中间溶剂清洗不干净

　　(3) 样品室温度高，注入CO2困难注入CO2量太少

　　(4) 样品室漏气

　　4.冷冻干燥法

　　冷冻干燥法是利用低温和真空,使样品中的水分直接由冰升华或经过某种升华介质由固相升华以达到干燥样品的目的。冷冻干燥过程使水分从固态直接转化为气态不经过液态阶段，因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤。根据选用的冷冻介质的不同，冷冻干燥法又可以分为从水中直接冷冻干燥和从有机溶剂中干燥。与水相比，有机溶剂在冰冻后形成非晶体固态不会产生冰晶损伤样品且能以z快的速度从固态升华大为缩短了干燥时间。

　　1.基本描述：将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。

　　2.含水样品直接冷冻干燥常规步骤： 取材→固定→冷冻保护处理→快速冷冻→升华(10-2乇)干燥→装台镀膜

　　3.样品脱水后的冷冻干燥基本描述：样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥

　　5.真空干燥法

　　真空干燥法指的是将经脱水的样品置于真空容器中进行干燥的方法。真空干燥法选用高熔点的有机材料(叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等)作升华介质，既保留了冷冻干燥法的优点又不用对样品进行冷冻处理无冷冻损伤，且操作简单。常用的真空干燥法是以叔丁醇为升华介质的叔丁醇干燥法。而乙腈干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、正丁醇干燥法等用的相对较少。

　　补充材料：

　　(1)对于微生物等微小的生物样品，如果想要操作简便，可以选用自然干燥法或烘干干燥法;如果想要获得较好的效果，建议选用临界点干燥法或真空干燥法。

　　(2)一般来说，含水量较少、细胞壁和蜡质层较厚的植物组织多采用自然干燥法，而幼嫩、含水分较多的组织则需要选择其他方法。临界点干燥法和叔丁醇真空干燥法几乎适用于各类型的植物样品。

　　(3)临界点干燥法是动物样品的首选干燥方法。考虑到操作的简便性，对于含水量低且观察部位相对较硬的动物样品也可以采用自然干燥法，但是含水量高且较柔软的样品推荐采用临界点干燥或叔丁醇真空干燥法。

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