外泌体提取、鉴定与 TEM 表征一站式实验

　　外泌体“提取 + 鉴定 + TEM 表征”一站式实验，是按 MISEV2023 指南完成三重正交鉴定：TEM 形态、NTA 粒径/浓度、WB 标志物，其中 TEM 负责证明“它是脂质双层囊泡”，但不能单独证明来源和纯度。

　　一站式实验流程

　　1. 样本来源与前处理

　　细胞培养上清：需使用无外泌体血清或无血清培养基，避免血清来源囊泡污染。

　　血清/血浆：采集后尽快低温离心去除细胞和碎片，避免溶血;肝素抗凝管不建议用于外泌体研究。

　　尿液、脑脊液、腹水、唾液等体液：需先去除细胞、沉淀和黏液杂质。

　　组织来源外泌体：通常需要先消化、匀浆、澄清后再进入分离流程。

　　2. 外泌体提取

　　常用方法可按需求选择：

　　差速超速离心：期刊认可度高，适合细胞上清和多数基础研究。

　　密度梯度超速离心：纯度更高，适合高要求机制研究。

　　尺寸排阻色谱 SEC：温和、杂质去除较好，适合血浆/血清和功能实验。

　　聚合物沉淀试剂盒：操作简单，但脂蛋白和蛋白共沉淀较多，不建议单独用于正式论文。

　　免疫磁珠分选：适合特定亚型富集，但通量低、成本高。

　　典型差速超速离心流程为：300 g 去除完整细胞 → 2000 g 去除死细胞碎片 → 10000 g 去除大囊泡/细胞器 → 100000 g 沉淀外泌体 → PBS 重悬后再次 100000 g 洗涤。

　　3. TEM 形态表征

　　TEM 主要看三点：粒径 30–150 nm、杯状/茶托状形态、脂质双层膜结构。

　　常用步骤：

　　外泌体悬液滴加到 Formvar/碳膜铜网上吸附;

　　用 2% 多聚甲醛或低浓度戊二醛短暂固定，提高膜结构保留;

　　用 1% 乙酸铀酰或磷钨酸进行负染;

　　室温或低温干燥后上机观察。

　　合格判读：随机视野中可见大量完整囊泡，粒径集中在 30–150 nm，膜边界清晰，无明显蛋白聚集体、盐结晶或大片无定形杂质。

　　常见失败原因包括：样本蛋白杂质过高导致全是蛋白团块;负染时间过长掩盖膜结构;外泌体浓度过低找不到视野;反复冻融导致囊泡破损。

　　4. NTA 粒径与浓度检测

　　NTA 用于输出粒径分布和颗粒浓度。合格结果通常表现为：

　　主峰集中在 50–120 nm;

　　30–150 nm 颗粒占主要比例;

　　PDI 尽量低于 0.2;

　　颗粒浓度通常在 10⁸–10¹¹ particles/mL 范围。

　　需要注意，NTA 计数的是“纳米颗粒总数”，脂蛋白、蛋白聚集体也可能被计入，所以不能只看颗粒数高就判断外泌体纯。

　　5. WB 标志物验证

　　WB 需要同时做阳性和阴性标志物：

　　阳性标志物：CD9、CD63、CD81、TSG101、ALIX，至少检出 2–3 个;

　　阴性标志物：Calnexin、GM130 等，应为阴性或极弱，用于排除内质网、高尔基体等细胞器污染。

　　只做阳性不做阴性，很多期刊会认为证据不足。

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