生物透射电镜TEM样品制样有哪些注意事项？

　　生物透射电镜(TEM)制样，本质上是在“高真空、电子束穿透”的极端物理限制下，尽可能保留生物样品的“天然超微结构”。由于生物样品含水且柔软，制样过程极易引入假象，因此每一步都需要严格控制。

　　下面是生物TEM样品制样的注意事项：

　　1. 取材阶段：快、小、准、冷

　　这是决定成败的第一步，90%的失败都源于取材不当。

　　快(速度)：组织离体后，细胞会迅速因缺氧发生自溶。必须在1-3分钟内将组织投入固定液，尤其是脑、肝等代谢旺盛的组织。对于脑、脊髓等难固定的组织，首选灌注固定(通过心脏或动脉注入固定液)，以实现原位快速固定。

　　小(尺寸)：固定液(戊二醛)渗透速度慢，样品过大会导致中心固定不良。组织块体积应控制在1mm³以内(约芝麻粒大小)，z窄面不超过1mm。

　　准(定位)：TEM观察的是二维截面，视野极小。取材必须精准定位到目标区域(如想看肾小球就必须取肾皮质)，且要注意组织的方向性(如管状组织需横切或纵切，肌组织需纵切以观察肌节)。

　　冷(温度)：操作器械(剪刀、镊子)和固定液需4℃预冷，以抑制酶活性，减少自溶。

　　2. 固定阶段：双重固定，锁住结构

　　生物样品需采用**“戊二醛+锇酸”双重固定法**，缺一不可。

　　前固定(戊二醛)：使用2.5%戊二醛(PBS配制，pH 7.2-7.4)，4℃固定2小时至过夜。戊二醛能强力交联蛋白质，保持细胞形态。

　　漂洗：用0.1M PBS缓冲液漂洗3-4次，每次15分钟，彻底洗去残留戊二醛，防止干扰后续反应。

　　后固定(锇酸)：使用1%锇酸，室温或4℃固定1-2小时。锇酸能固定脂质(如细胞膜、线粒体膜)，并增加样品电子密度(天然染色)。

　　⚠️ 安全警示：锇酸具有剧毒和挥发性，必须在通风橱内操作，佩戴手套和护目镜，废液需专门回收。

　　3. 脱水与包埋：梯度过渡，防止收缩

　　生物样品含水，而电镜需高真空，必须彻底脱水并置换为树脂。

　　梯度脱水：严禁直接放入高浓度脱水剂!需使用乙醇或丙酮进行梯度脱水(如30%→50%→70%→80%→90%→100%)，每级停留15-20分钟，防止细胞因渗透压剧变而收缩变形。

　　渗透与包埋：使用丙酮与环氧树脂(如Epon 812)按梯度比例(如2:1→1:1→纯树脂)进行渗透，确保树脂完全置换脱水剂。z后注入包埋模具，60℃聚合48小时，形成坚硬的树脂块。

　　4. 切片与染色：厚度与反差

　　超薄切片：使用超薄切片机(配备玻璃刀或钻石刀)将树脂块切成50-100nm厚的切片(约为红细胞直径的1%)。切片过厚电子束无法穿透，过薄则结构不完整。切片需漂浮在液槽上，用铜网捞取。

　　重金属染色：生物样品主要由轻元素(C、H、O、N)组成，电子散射能力弱，反差极低。必须进行铀铅双染色(醋酸铀+柠檬酸铅)，利用重金属盐增加电子密度，增强图像反差。

　　注意：柠檬酸铅易与空气中的CO₂反应生成碳酸铅沉淀，染色时需在密闭容器中进行，并避免对着样品呼吸。

　　5. 特殊样品的处理

　　悬浮细胞/细菌：需先离心成团(大小不超过半颗绿豆)，再进行固定和包埋。

　　病毒/外泌体/纳米颗粒：无需切片，可采用负染色法。将样品滴在覆膜铜网上，用磷钨酸或醋酸铀染色，观察其轮廓。

　　长突起细胞：不宜离心，可直接加满小管送检微粒悬液，由技术人员进行富集处理。

　　6. 常见避坑指南

　　冰袋风险：化学固定后的样品绝对不能结冰!冰晶会刺破细胞膜，彻底破坏结构。运输时若用冰袋，务必用海绵隔开，防止冻伤。

　　样品污染：全程戴手套，使用高纯度试剂。铜网使用前可用乙醇清洗，避免灰尘和油污干扰。

　　载网选择：若需进行能谱分析(EDS)，且需检测铜元素，禁用铜载网，应选用镍网或金网，避免背景干扰。

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