肾脏肾小球半薄定位染色 TEM 观测操作要点

　　肾脏肾小球半薄切片定位染色是TEM制样流程中"精准导航"的核心环节，直接决定超薄切片能否切到目标肾小球，避免"盲切"导致制样失败。下面是基于行业实操的操作要点详解：

　　一、半薄切片制备

　　1. 修块

　　将完全聚合的Epon812树脂包埋块固定在修块机上，在体视显微镜下用锋利刀片削去多余树脂，暴露出肾组织切面;

　　将修好的组织面修整为梯形或长方形(边长约0.2-0.5mm)，确保切面平整、无毛刺，且目标区域(皮质区)位于修块面中央。

　　2. 切片厚度与操作

　　使用超薄切片机配合玻璃刀或钻石刀，切取厚度1-2μm的半薄切片(常规TEM超薄切片仅50-100nm，半薄切片厚度约为其20-40倍);

　　切片时刀槽内加入超纯水，水位以呈现"反光镜面"为宜，切片连成带状漂浮于水面;

　　用细针或镊子将切片转移至滴有超纯水的洁净载玻片上，置于45-60℃加热板上烘干展平，使切片紧贴玻片。

　　二、甲苯胺蓝染色(定位染色核心)

　　1. 染色前处理(关键!)

　　环氧树脂包埋的半薄切片因聚合树脂阻碍染液渗透，染色前需进行脱树脂处理：使用NaOH-无水乙醇饱和溶液浸泡30-60min，或用2.5%高碘酸处理10min去除锇酸(锇酸会封闭嗜酸/嗜碱性基团，影响染色效果);

　　若使用亲水性LR White树脂包埋，则无需脱树脂步骤。

　　2. 染色操作

　　将切片置于1%甲苯胺蓝染液中，在60℃烤箱或加热板上恒温染色1-2min(也可室温染色5-10min，根据组织类型调整);

　　染色过程中可在酒精灯上微热数秒(严禁煮沸，防止切片炸裂或掉片);

　　待染液周围出现金色环带或镜下观察染色适度后，用蒸馏水冲洗去除多余染液。

　　3. 分化与封片

　　用95%酒精快速分化，同时在光镜下实时监控颜色变化——肾小球毛细血管袢呈深蓝色、基底膜清晰可辨、系膜区结构分明即为z佳状态;

　　分化后蒸馏水漂洗2-3次，烤干后滴加中性树胶封片(甲苯胺蓝为水溶性染料，严禁使用水性封片剂，否则会褪色)。

　　三、光镜定位与修块调整

　　1. 定位观察

　　将染色后的半薄切片置于光学显微镜下(40×或100×物镜)，系统扫描整个组织切面;

　　重点寻找肾小球结构完整、基底膜清晰、足突区域可辨的目标肾小球，记录其在包埋块上的相对位置坐标。

　　2. 精修包埋块

　　根据光镜定位结果，返回修块机对包埋块进行二次精修：将目标肾小球周围的多余树脂进一步削去，使修块面缩小至仅包含1-2个目标肾小球(修块面边长控制在0.2-0.3mm);

　　修块面必须与目标肾小球的切面严格平行，确保后续超薄切片能完整切出肾小球的横截面(而非斜切或纵切)。

　　3. 定位质量判定标准

　　合格的半薄定位切片应能清晰显示：肾小球毛细血管袢轮廓、基底膜连续性、系膜细胞与基质分布、足细胞位置;

　　若半薄切片中肾小球结构模糊、基底膜断裂或切片皱褶，说明修块或染色存在问题，需重新制片。

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