非靶向代谢组样本前处理注意事项？

　　非靶向代谢组学的前处理是决定数据质量的关键环节，代谢物稳定性差、浓度跨度大、基质效应显著，任何一步操作偏差都可能导致代谢谱发生系统性偏移。下面按流程整理相关注意事项。

　　样本采集与保存

　　这是容易被忽视但影响z大的环节，代谢物在离体后仍在持续变化，必须快速"淬灭"代谢活动。

　　通用原则：全程低温操作(4℃或冰上)，采集后立即液氮速冻，-80℃保存，干冰运输;分装保存避免反复冻融(冻融次数不超过4~6次);同一批实验的采样时间、部位、处理条件必须严格一致。

　　不同样本类型的关键差异：

　　血清/血浆：血清用红帽管(不加抗凝剂)，血浆推荐EDTA抗凝剂，不推荐柠檬酸钠(因其为三羧酸循环中间产物，会干扰代谢谱)，肝素在质谱平台可能产生干扰。采血后颠倒混匀510次，3000 rpm 4℃离心1015 min取上清，严重溶血样本需重采。

　　尿液：取晨起中段尿，1000 rpm 4℃离心5 min或0.22 μm滤膜过滤取上清。不建议添加叠氮化钠等抑菌剂(会干扰质谱信号)。需记录采集时间，后续考虑稀释校正。

　　动物/植物组织：剔除结缔组织、脂肪等杂质，PBS漂洗后吸水纸吸干，液氮冷冻至少15 min。非靶向建议每管≥122 mg(z低60 mg)，植物组织100 mg1 g，动物组织30200 mg。根部、果实、种子建议用离心管而非锡箔纸包裹。

　　细胞：贴壁细胞不建议用胰蛋白酶消化(会引入外源代谢物)，建议用细胞刮刮取或加入预冷有机溶剂(甲醇/乙腈/水混合液)刮取收集。悬浮细胞PBS清洗2次，取1×10⁷ cells/样。

　　代谢物提取

　　提取溶剂的选择直接决定代谢物覆盖范围，是非靶向分析中"漏检"与"偏差"的主要来源。

　　溶剂选择策略：

　　甲醇/乙腈(1:1)：综合z优选择，甲醇高效提取极性代谢物，乙腈沉淀蛋白效果好，覆盖范围广，基质效应小，重复性好。

　　纯甲醇(80%~100%)：极性代谢物提取效率高，但基质效应较大，部分脂质提取不足。

　　MTBE/甲醇/水双相体系：上层有机相提取脂质，下层水相提取极性代谢物，适合需要同时覆盖两类的实验。

　　氯仿/甲醇/水(Bligh-Dyer改良)：适合同时提取极性代谢物和脂质。

　　操作要点：

　　提取溶剂必须预冷至-20℃或更低，提高代谢物稳定性。

　　样本与提取剂体积比通常为1:31:4，涡旋混匀后-20℃静置3060 min(z佳约45 min，延长收益不明显)，1200014000 rpm 4℃离心1015 min取上清。

　　整个批次内的处理时间必须保持一致，避免因提取时间差异引入系统偏差。

　　冰水浴超声可辅助提取(通常10 min)，但需注意超声产热导致代谢物降解。

　　内标添加

　　内标用于校正前处理损失和仪器响应波动，添加策略直接影响数据可靠性。

　　添加时机：建议在样品前处理前添加(监控整个流程的损失)，而非提取后添加(仅能监控仪器稳定性)。

　　内标类型：选择覆盖不同化学性质和保留时间的同位素标记内标，如氨基酸类用¹³C或¹⁵N标记，脂质类用d₃/d₄/d₇标记，有机酸类用¹³C标记。常用L-2-氯苯丙氨酸(氨基酸类)和Lyso PC17:0(脂质类)组合。

　　浓度控制：中等浓度范围，避免过高或过低导致信号饱和或检测不到。

　　QC样本与质量控制

　　QC是判断整批数据是否可信的核心依据，设计不当会导致后续分析全部作废。

　　Pooled QC制备：从所有实验样品中各取等量混合均匀，分装冻存于-80℃。样本数≤50个时，每样取等体积混合，总体积不少于实验样本两倍;样本数>50个时，每组随机抽取35个样本混合，共混合2030个样本。

　　进样策略：梯度开始前先进样35针QC平衡系统，每10个样品插入1针QC，分析序列结束时再进23针QC评估系统稳定性。

　　判定标准：QC样本中代谢物峰面积的RSD < 30%为可接受，< 20%为良好，< 15%为优秀。PCA分析中QC样本应紧密聚集。

　　Blank QC：用提取溶剂代替样品进行相同前处理，用于识别背景噪音和系统污染特征，后续数据处理时剔除。

　　浓缩与复溶

　　浓缩方式选择：

　　真空离心浓缩(SpeedVac)：温和干燥，适合热不稳定代谢物，温度控制在30~40℃，避免过度干燥(部分代谢物过度干燥后难以复溶)。

　　冷冻干燥：适合水溶性代谢物，但耗时长(通常过夜)，挥发性代谢物会损失。

　　氮吹：速度快但局部温度高，对热敏感代谢物不友好。

　　复溶溶剂：需与色谱条件匹配，避免溶剂效应导致峰形变差。极性代谢物推荐70%乙腈+20%水+10%甲醇或纯水(HILIC模式);脂质推荐90%甲醇+10%氯仿或异丙醇/乙腈(1:1);综合代谢物推荐50%甲醇/水，含0.1%甲酸增强离子化。

　　复溶后涡旋混匀、室温离心2 min(14100 g)，取上清转移至LC-MS小瓶。

　　其他关键注意事项

　　耗材等级：全程使用LC-MS级溶剂和耗材，避免塑化剂、增塑剂等背景污染。

　　随机化处理：样本处理和进样顺序应随机化，避免批次效应与分组因素混淆。

　　禁用物品：不使用玻璃容器(可能吸附代谢物)、透明胶带、纱布/纸张直接包裹样本。

　　保存时效：-80℃保存建议不超过2年，1年内使用效果更佳。

　　生物学重复：动物样本每组≥10个，临床样本每组≥30个，细胞/微生物/植物样本每组≥6个。

       来源：网络