非靶向代谢组学生物样本前处理规范

　　非靶向代谢组学旨在全面捕获样本中的代谢物信息，但由于代谢物种类复杂、理化性质差异大且极易降解，实验流程中的每一个环节都直接影响z终数据的可靠性。下面是规范的生物样本前处理全流程及关键控制点：

　　一、 样品采集与保存

　　统一采样条件：代谢物水平易受环境因素影响，需固定采样时间(如晨起空腹)，并保持实验条件(温度、光照等)一致。

　　快速终止代谢反应：细胞或组织离体后代谢反应仍会持续，需迅速“淬灭”(quenching)代谢活动。组织样本应使用液氮快速冷冻;细胞样本需使用预冷甲醇或PBS快速洗涤并冷冻。

　　低温保存：生物样本(血液、尿液、组织、细胞等)采集后需快速低温处理(液氮速冻或-80℃保存)，避免代谢物降解，且必须避免反复冻融。

　　二、 代谢物提取策略

　　非靶向代谢组学通常采用广谱提取方法，以尽可能覆盖极性和非极性代谢物：

　　极性代谢物提取：常采用甲醇/水体系(如80%-100%甲醇或甲醇-乙腈混合液)进行提取。

　　脂质类代谢物提取：采用MTBE或氯仿/甲醇体系(如Bligh-Dyer改良法)进行分层提取。

　　双相提取：使用MTBE/甲醇/水或氯仿/甲醇/水体系，可同时获得极性代谢物和脂质组分。

　　注意：提取溶剂需预冷(-20°C或更低)，以提高代谢物稳定性。

　　三、 样品净化与离心

　　蛋白质会干扰质谱分析，因此需通过有机溶剂沉淀去除：

　　离心除杂：通常在4°C下，以≥12,000 g(或17,000 g)离心10-15分钟，收集上清液用于后续分析。

　　固相萃取(SPE)：对于复杂样本(如血浆)，可使用SPE柱或EMR-Lipid板去除磷脂等干扰物，以提高极性代谢物检测灵敏度并减少离子抑制效应。

　　四、 样品浓缩与复溶

　　为提高检测灵敏度，样品通常需进行浓缩处理：

　　干燥浓缩：采用真空离心干燥(SpeedVac)或氮吹干燥，温度控制在30-40°C，避免热降解及过度干燥。

　　溶剂复溶：使用适合LC-MS的溶剂(如50%甲醇/水、70%乙腈水溶液或含0.1%甲酸的溶剂)复溶，复溶溶剂需与色谱条件匹配，以避免峰形异常。

　　五、 质量控制(QC)与内标

　　质量控制是非靶向代谢组学数据可信度的保障：

　　QC样本制备：由所有实验样本等比例(如各取10 μL)混合而成，用于评估仪器稳定性、监测信号漂移及后续数据校正。

　　QC进样策略：在梯度开始前进样3-5针QC平衡系统，分析过程中每隔5-10个样本插入1针QC，分析序列结束时再进样2-3针QC。

　　内标添加：添加覆盖不同极性和保留时间范围的稳定同位素标记内标物(如¹³C、¹⁵N标记)，用于校正样品处理过程中的损失，评估仪器响应一致性。

　　Blank QC(空白对照)：使用提取溶剂代替样品进行相同前处理，用于识别背景噪音、去除污染特征及评估系统污染。

       来源：网络