生物扫描电镜 SEM 细胞表面形貌测试流程

　　生物扫描电镜(SEM)观察细胞表面形貌是一项对制样要求极高的技术。生物样品具有含水、绝缘、质地脆弱的特点，业内常说“七分靠制样，三分靠参数”。下面是标准化的细胞表面形貌测试全流程：

　　一、 制样流程

　　1. 取材与清洗

　　贴壁细胞：必须采用爬片(盖玻片)培养，严禁直接刮取细胞，以防细胞膜破损。处理完成后，弃去培养基，使用 0.1 mol/L PBS 磷酸缓冲液(pH=7.4)轻轻漂洗，去除表面残留的培养基和黏液。严禁使用纯水冲洗，以免渗透压失衡导致细胞破裂。

　　悬浮细胞：离心收集(通常1500-3000转，5-10分钟)，使细胞在管底形成肉眼可见的芝麻至绿豆大小的沉淀，弃上清后用PBS轻柔漂洗。

　　2. 双固定(锁住原生形态)

　　前固定：加入 2.5% 戊二醛溶液，室温固定2小时或4℃避光固定2-4小时(也可过夜)，以固化蛋白质。

　　缓冲漂洗：用 0.1M PB(pH 7.4)漂洗3次，每次15分钟，洗净残留固定液。

　　后固定：加入 1% 锇酸(剧毒，需在通风橱避光操作)，室温固定1-2小时，以固定细胞膜脂质并提升成像对比度。z后再用 0.1M PB 漂洗3次，每次15分钟。

　　3. 梯度脱水与干燥

　　梯度脱水：为防止表面张力撕碎细胞结构，必须使用乙醇逐级脱水。依次经过 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100% 乙醇，每级停留约15分钟。

　　置换：使用醋酸异戊酯处理15分钟，消除乙醇的表面张力。

　　干燥：必须采用临界点干燥仪进行干燥。严禁自然风干或烘箱烘干，否则细胞会严重皱缩塌陷。

　　4. 粘样与导电镀膜

　　将干燥后的样品(或爬片)用导电碳胶牢固粘贴在样品台上，防止上机时飞样。

　　由于细胞绝缘，必须放入离子溅射仪中进行喷金或喷碳处理(通常约30秒，膜厚控制在5-10 nm)，以消除荷电效应并提升信噪比。

　　二、 SEM 上机观测参数

　　成像模式：统一使用 SE(二次电子)模式，严禁使用 BSE(背散射)模式(生物元素组成相近，BSE模式会呈现灰白一片，无微观细节)。

　　加速电压：控制在 1.0～3.0 kV 之间(生物样品严禁高压，否则极易灼伤细胞)。

　　工作距离：设定在 4～6 mm，以获得更好的立体感和景深。

　　三、 常见翻车问题与避坑指南

　　细胞塌陷、组织皱缩：通常是因为脱水过快、省略了双固定步骤或未使用临界点干燥。

　　图像发白、边缘过曝、画面闪烁：典型的荷电效应。需检查是否喷金过薄或加速电压过高。

　　画面模糊、噪点多：多为加速电压设置过高(生物样品应≤3 kV，切勿套用无机材料的高压参数)。

　　表面杂点多：PBS漂洗不彻底，残留了固定剂或培养基，需延长漂洗时间。

       来源：网络