SDS-PAGE 凝胶配制与蛋白电泳染色步骤

　　SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)是分子生物学中分离蛋白质的重要技术。下面是凝胶配制与蛋白电泳染色的详细步骤：

　　一、 凝胶配制步骤

　　凝胶通常由下层的分离胶(Resolving gel)和上层的浓缩胶(Stacking gel)组成。

　　配制分离胶：根据目标蛋白的分子量大小，选择合适的丙烯酰胺浓度(通常在8%-15%之间)。将丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液、Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、SDS和蒸馏水混合。为去除气泡，可将溶液脱气几分钟。

　　引发聚合：在灌胶前，迅速加入过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)以引发聚合反应。

　　灌胶与压平：将混合液快速、平稳地注入玻璃板之间，并在液面上方小心覆盖一层异丙醇或蒸馏水，以排出气泡并使凝胶上沿平直。静置30-60分钟等待聚合。

　　配制浓缩胶：分离胶凝固后，倒去覆盖液并用滤纸吸干水分。配制低浓度(通常为4-5%)、低pH值(pH 6.8)的浓缩胶溶液，同样加入APS和TEMED后，将其加在分离胶上方。

　　插梳与聚合：在浓缩胶中平稳插入梳子以形成加样孔，避免产生气泡。静置30-45分钟使其完全聚合。

　　二、 电泳操作步骤

　　准备电泳槽：小心拔出梳子，用运行缓冲液冲洗加样孔。将凝胶板固定在电泳槽中，加入SDS运行缓冲液，确保凝胶完全浸没。

　　样品处理：将蛋白样品与上样缓冲液(含SDS、甘油、溴酚蓝及还原剂如DTT)混合，在95-100℃下加热5分钟，使蛋白质变性并带上均匀的负电荷。

　　加样与电泳：使用微量移液器将样品和分子量标准蛋白(Protein ladder)加入孔中。连接电源，初始电压设定为70-100 V用于浓缩阶段，待蛋白进入分离胶后，将电压提高至100-150 V继续电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部(通常需1-2小时)。

　　三、 蛋白染色与观察步骤

　　电泳结束后，需对凝胶中的蛋白质进行染色以可视化。目前主要有以下两种染色方案：

　　传统考马斯亮蓝染色法：

　　将凝胶浸泡在考马斯亮蓝染色液中，温和摇晃数小时或过夜。

　　随后将凝胶转移至脱色液中，多次更换脱色液，直至蛋白条带在清晰的背景下显现。

　　一步法快速蛋白染色法：

　　电泳后的凝胶无需固定、加热或脱色，只需用蒸馏水简单漂洗后，直接浸入快速染色液中。

　　在室温下温和摇晃，根据蛋白量不同，条带可在2分钟至60分钟内显现。此方法安全环保(不含甲醇和强酸)，且凝胶可长时间留在染色液中而不会增加背景。

　　z后，通过对比样品条带与分子量标准蛋白的位置，即可分析目标蛋白的分子量、纯度及相对定量。

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