细菌 16S rDNA、真菌 ITS 测序菌株鉴定流程

　　针对细菌和真菌的分子鉴定，16S rDNA(针对细菌/原核生物)和 ITS 序列(针对真菌)是目前行业内通用、权威的“分子条形码”。结合权威资料，下面介绍测序鉴定的标准流程：

　　一、 细菌 16S rDNA 鉴定流程

　　16S rDNA 存在于所有细菌染色体中，包含高度保守区和可变区(V1-V9)，常被用作细菌系统分类的“分子钟”。

　　1. 基因组 DNA 提取

　　挑取单菌落接种至液体培养基中培养，随后通过物理破碎、化学裂解及纯化等步骤，从细菌样本中提取出高纯度的总基因组 DNA。

　　2. PCR 扩增

　　利用 16S rDNA 序列中高度保守的区域设计通用引物(如 27F/1492R 或 338F/806R)，通过 PCR 技术特异性扩增出包含可变区(如 V3-V4 区)的目标片段。

　　3. 产物纯化与测序

　　对 PCR 扩增产物进行纯化，去除杂质。对于单一菌株鉴定，通常采用 Sanger 测序(一代测序);若为复杂群落分析，则构建文库进行高通量测序(NGS)。

　　4. 序列比对与系统发育分析

　　将获得的序列与公共数据库(如 GenBank、SILVA、RDP)中的已知序列进行比对(BLAST分析)。根据序列相似度确定菌属和菌种，必要时可构建系统发育树以分析亲缘关系。

　　二、 真菌 ITS 测序鉴定流程

　　ITS(内转录间隔区)位于真菌核糖体 DNA 的 18S 和 28S 基因之间，包含 ITS1、5.8S rDNA 和 ITS2。由于该区域选择压力小、变异快，表现出“种内一致、种间差异明显”的特点，是真菌鉴定的首选靶标。

　　1. 真菌 DNA 提取

　　收集纯化培养的菌丝体，通常需加入液氮在研钵中充分研磨成粉末，破坏坚韧的真菌细胞壁，随后使用真菌基因组抽提试剂盒提取 DNA。

　　2. PCR 扩增

　　采用真菌通用引物(如 ITS1F 和 ITS4)对 ITS 区域进行 PCR 扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小与质量。

　　3. 上机测序

　　对合格的扩增产物进行纯化并上机测序。针对单株真菌鉴定多采用 Sanger 测序，针对环境样本中的真菌群落多样性分析则多采用 MiSeq 等平台的扩增子测序。

　　4. 序列拼接与物种注释

　　对测序得到的原始数据进行质控、拼接。将高质量序列提交至 GenBank 或 UNITE 等权威数据库进行 BLAST 比对，从而将真菌精准鉴定到“种”的水平。

　　三、 注意事项与局限性

　　鉴定精度限制：对于部分近缘细菌，单独依靠 16S rDNA 可能难以精确区分到“种”，需结合其他鉴定方法(如生化鉴定或全基因组测序)进行补充。

　　防污染控制：两项技术均基于 PCR 扩增，实验过程中极易发生外源 DNA 污染导致假阳性，因此必须严格设立阴性对照。

　　数据库质量：分子鉴定的准确性高度依赖于公共数据库中序列信息的完整性与分类学注释的可靠性。

       来源：网络