ELISA 酶联免疫吸附实验原理与样品要求

　　酶联免疫吸附实验(ELISA)是一种应用广泛的免疫分析技术，它巧妙地将抗原与抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用相结合，用于精确定量或定性检测样品中的蛋白质、抗体、激素等微量物质。

　　一、 ELISA 实验原理

　　ELISA 的核心在于“抗原-抗体特异性结合”与“酶催化显色反应”的结合。以常用的双抗体夹心法为例，其典型步骤如下：

　　固相化(包被)：将能特异性识别目标分子的捕获抗体固定在微孔板等固体载体表面。

　　结合：加入待测样品，样品中的目标分子(抗原)会与固相上的捕获抗体特异性结合，随后洗去未结合的杂质。

　　检测：加入与酶偶联的检测抗体，该抗体能与目标分子的另一位点结合，形成“抗体-抗原-抗体”的夹心复合物，再次洗涤去除多余的酶标抗体。

　　显色与定量：加入酶的底物，复合物上的酶会催化底物发生反应，产生颜色等可测量的信号。信号的强度与样品中目标分子的浓度成正比，通过与标准曲线比对即可计算出准确浓度。

　　二、 常见样品类型及制备要求

　　ELISA 可检测多种类型的样本，为确保实验的准确性，样品必须清晰透明且不含沉淀物。不同样本的处理规范如下：

　　1. 血清样本

　　制备：使用无热原、无内毒素的试管收集血液，室温下自然凝固1-2小时(或4℃过夜)，随后在2-8℃下以1000×g离心20分钟，小心收集上清液。

　　注意：必须避免溶血和高血脂。红细胞溶解会释放具有过氧化物酶活性的物质，导致非特异性显色和假阳性结果。

　　2. 血浆样本

　　制备：使用含抗凝剂(推荐EDTA-Na2、肝素钠或柠檬酸钠)的采血管收集血液，采集后30分钟内于2-8℃下以1000×g离心15分钟，收集上清液。

　　注意：需确认试剂盒对特定抗凝剂是否有特殊要求，同样需避免溶血。

　　3. 细胞培养上清

　　制备：将细胞培养液吸入离心管中，在2-8℃下以1000×g离心20分钟，去除细胞碎片和杂质，收集上清液备用。

　　注意：建议制备无血清或低血清培养基样本，因为血清中的细胞因子可能会产生显著的背景信号。

　　4. 细胞裂解液

　　制备：收集细胞并用预冷的PBS洗涤3次。加入适量预冷PBS(推荐加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞，通过反复冻融或超声破碎使细胞裂解。z后在2-8℃下以1500×g离心10分钟，取上清检测。

　　注意：不建议使用含强变性剂(如>0.1% SDS)的商业裂解液，以免破坏分析物的天然构象导致假阴性。

　　5. 组织匀浆

　　制备：用预冷PBS冲洗组织去除残留血液，称重后剪碎。按1:9的重量体积比(如1g组织加9mL PBS，推荐加入蛋白酶抑制剂)加入PBS，在冰上充分匀浆。随后在2-8℃下以5000×g离心5-10分钟，收集上清液。

　　三、 样本保存与通用注意事项

　　保存条件：若样本在一周内检测，可存放于4℃;若需长期保存，必须分装后置于-20℃或-80℃冷冻保存(-20℃可保存1个月，-70℃可保存6个月)。

　　避免反复冻融：蛋白极易在冻融过程中降解，严重影响实验质量，因此务必提前分装保存。

　　样本稀释：血清、血浆及细胞/组织提取液通常建议使用结合缓冲液进行50%的稀释后再进行检测。

       来源：网络