动物组织切片半薄、超薄电镜样品制备方法

　　动物组织的半薄切片(0.5~2 μm)和超薄切片(40~100 nm)是透射电镜(TEM)样品制备中经典、应用广泛的技术路线。两者共享同一套前处理流程(取材→固定→后固定→脱水→渗透→包埋)，区别在于切片厚度、刀具选择和染色方式。半薄切片用于光镜定位目标区域，超薄切片用于电镜观察超微结构，二者构成"先导航、后精切"的完整工作流。

　　一、取材

　　取材是整个流程的第一步，也是决定后续切片质量的基础。核心原则为"快、小、准、轻、冷"。

　　快：标本离体后必须在半分钟至2分钟内浸入固定液，防止细胞自溶。

　　小：组织块体积不超过1 mm³(约1 mm × 1 mm × 1 mm)，确保固定液能充分渗透至中心。

　　准：取材部位精确，注意组织方向性(如肌纤维的纵断与横断)。

　　轻：操作轻柔，避免牵拉、挤压造成机械损伤，使用锋利器械。

　　冷：在0~4℃低温条件下操作，所有容器、器械和固定液均需预冷，降低自溶酶活性。

　　对于灌注固定的组织(如心脏、脑组织)，可先经心尖灌注冷固定液使组织充分固定后再取材，固定效果优于单纯浸泡固定。

　　二、固定

　　固定的目的是在分子水平上将组织和细胞的结构精确保存下来，使其尽可能接近生活状态。

　　1. 前固定(醛类固定)

　　常用的前固定剂为戊二醛，对蛋白质交联能力强，能较好地保存膜性结构(线粒体、内质网等)和糖原。

　　常用浓度：2.5%戊二醛，用0.1 M磷酸缓冲液或0.1 M二甲砷酸钠缓冲液配制，pH 7.2~7.4

　　固定时间：4℃下固定2~24小时(视组织类型而定)

　　对于不易渗透的组织，可采用抽真空方式加速固定液渗透

　　也可采用戊二醛与多聚甲醛的混合固定液(如2.5%戊二醛 + 4%多聚甲醛)，兼顾蛋白交联和结构保存。

　　2. 漂洗

　　醛类固定后，用同种缓冲液漂洗2~3次，每次5~20分钟，彻底去除残留醛基，避免其与后续锇酸反应产生沉淀。

　　3. 后固定(锇酸固定)

　　锇酸(OsO₄)是电镜样品制备中不可替代的后固定剂，具有三重作用：固定脂质、提供电子反差(锇与不饱和脂肪酸结合后增加膜结构电子密度)、增强组织硬度便于切片。

　　常用浓度：1%~2% OsO₄，用同种缓冲液配制，pH 7.2~7.4

　　固定时间：室温下1~2小时(锇酸渗透速度约0.1~0.3 mm/h，不宜过久，否则组织过脆)

　　注意事项：锇酸剧毒且易挥发，全程在通风橱中操作;锇酸遇光热易分解，需现用现配;所有试剂不得接触金属器具

　　后固定完成后，再次用缓冲液或双蒸水漂洗2~3次，去除多余OsO₄。

　　三、脱水

　　脱水的目的是用有机溶剂逐步取代组织中的游离水，为后续树脂渗透创造条件。脱水不彻底会导致树脂渗透受阻、组织结构受损;脱水过度则会造成组织内含物被过度抽提。

　　常用脱水剂为乙醇或丙酮，采用梯度递增方式：

　　关键要点：必须从低浓度开始逐步递增，不可直接跳入高浓度，否则组织快速脱水会导致严重收缩，破坏超微结构。

　　四、渗透与包埋

　　渗透是用树脂逐步取代脱水剂，使树脂充分填充细胞内外空隙的过程。

　　1. 环氧树脂体系(常用)

　　采用树脂与脱水剂(丙酮或乙醇)的梯度混合液进行渗透：

　　树脂:丙酮 = 1:1，室温渗透1小时

　　树脂:丙酮 = 3:1，室温渗透3小时

　　纯树脂，室温渗透过夜(或数小时)

　　随后将组织转入包埋模具(胶囊或平板模具)，调整方向后灌满新鲜树脂，放入60~70℃烘箱聚合24~48小时。

　　2. 亲水性树脂体系(适用于免疫电镜/CLEM)

　　若后续需进行免疫标记或关联光镜-电镜(CLEM)研究，推荐使用LR White等亲水性树脂。其渗透流程为：

　　用DMSO梯度(30%→50%→75%→90%→100%)替代乙醇脱水

　　LR White树脂与DMSO梯度混合渗透(30%→50%→70%→100%树脂×3次)

　　50℃真空烘箱聚合24~48小时

　　亲水性树脂对蛋白抗原的保存优于环氧树脂，是免疫电镜的首选包埋介质。

　　五、半薄切片制备

　　半薄切片的核心功能是定位——在光镜下确认目标区域后，指导后续超薄切片的精确切割。

　　1. 修块

　　用刀片将聚合好的树脂包埋块修整成梯形或金字塔形，使目标组织位于顶端，切除面尽量小(不超过1 mm)，以减少切片阻力。

　　2. 切片

　　刀具：玻璃刀(需配合水槽使用)或金刚石组织刀(Histo knife)

　　厚度：0.5~2 μm(常用0.5~1 μm)

　　切片机：超薄切片机(如Leica UC7)

　　切片在水槽中展开后，用捞片环或EM loop工具捞起，贴附于载玻片上

　　3. 染色与光镜观察

　　常用的染色方案为甲苯胺蓝(Toluidine Blue)染色：

　　将载玻片置于45℃热板上预热

　　滴加1%甲苯胺蓝染液(用1%硼砂溶液配制，pH 9~10)，恒温染色

　　待染液液滴周围出现金色环带后，用蒸馏水冲洗多余染液

　　烤干后在光学显微镜(10×~40×)下观察

　　甲苯胺蓝是异染性染料，细胞核呈蓝紫色，细胞质呈淡蓝色，可清晰分辨组织结构层次。根据光镜定位结果，用针或尖头镊子在树脂块表面标记目标区域(如特定细胞层、病变区域)，然后调整切割角度和深度，进入超薄切片环节。

　　六、超薄切片制备

　　超薄切片是电镜观察的核心环节，切片质量直接决定z终图像分辨率。

　　1. 精修块面

　　根据半薄切片定位结果，用刀片将树脂块切割面进一步精修，确保目标区域位于切割面中央，且切割面面积小于铜网支持膜的有效区域。

　　2. 切片

　　刀具：金刚石刀(Ultra 45°刀)，刀刃质量直接影响切片平整度

　　厚度：40~100 nm(常规观察70 nm左右，免疫电镜可切至90~120 nm)

　　切片在水槽中展开，通过干涉色判断厚度：银灰色约70 nm，浅棕色约90 nm，深棕色约120 nm

　　3. 捞片

　　用覆有支持膜(Formvar膜或碳膜)的铜网(常用200 mesh)从水槽中捞取切片。操作时用盖玻片镊子夹持铜网，调整膜面与水面的角度，使膜面平行于切片，提高捞片成功率。

　　七、超薄切片染色

　　超薄切片需经重金属电子染色以增加不同结构的电子反差。标准方案为醋酸铀-柠檬酸铅双染法：

　　1. 醋酸铀染色(铀染)

　　染液：2%~4%醋酸铀水溶液(避光保存)

　　方法：将铜网切片面朝下，反扣在染液液滴上，室温避光染色5~10分钟

　　醋酸铀主要与核酸、蛋白质结合，增强细胞核和核糖体的反差

　　2. 清洗

　　用双蒸水依次漂洗3次(每次在纯水液滴中蘸洗10次)，彻底去除残留铀盐。

　　3. 柠檬酸铅染色(铅染)

　　染液：3%柠檬酸铅溶液

　　方法：将铜网转移至柠檬酸铅液滴上，染色5~10分钟

　　柠檬酸铅主要与膜结构结合，增强细胞膜、线粒体膜等膜性结构的反差

　　注意：铅染液易与空气中CO₂反应生成碳酸铅沉淀，操作时需在液滴旁放置NaOH颗粒吸收CO₂

　　4. z终清洗与干燥

　　用双蒸水漂洗3次，滤纸吸干多余水分，室温自然干燥20~30分钟后即可装入TEM样品杆观察。

　　八、TEM观察

　　将干燥后的铜网装入TEM样品杆，在80~120 kV加速电压下进行观察和图像采集。常规观察从低倍(1000×~3000×)开始定位，逐步提高放大倍数至目标区域(5000×~50000×)。

       来源：网络