抑菌圈打孔法 / 滤纸片法实验操作规范

　　打孔法与滤纸片法的核心区别在于加样方式不同：打孔法在琼脂中挖孔加液样，加样量精确可控、适合液体/半固体样品;滤纸片法将药液吸附于纸片贴于琼脂表面，操作简便、适合药敏纸片或固体提取物，但加样量受纸片吸附能力限制。两者均基于琼脂扩散原理，通过抑菌圈直径评估抑菌活性。

　　实验原理

　　两种方法均基于琼脂扩散原理：将待测抑菌物质置于接种有指示菌的琼脂平板上，抑菌物质在琼脂中向四周呈球面扩散，形成浓度梯度。在抑菌浓度范围内，细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈直径越大，说明抑菌活性越强。

　　打孔法(Well Diffusion Method)

　　菌悬液制备

　　将培养18~24小时的新鲜斜面培养物用PBS或生理盐水洗下，利用比浊法调整至所需浓度(通常为5×10⁵~5×10⁶ CFU/mL)。

　　制备含菌平板

　　混菌倾注法：向融化并冷至40~45℃的培养基中接入菌悬液(约1%)，混匀后倾注平皿(每皿约15~20 mL)，静置凝固。

　　涂布法：先倒好普通琼脂平板，取0.1 mL菌悬液滴于平板表面，用无菌L型玻棒涂布均匀。

　　打孔

　　使用灭菌打孔器(常用直径6 mm的不锈钢管或微量移液器枪头)在琼脂上打孔。

　　各孔中心间距≥25 mm，与皿边缘距离≥15 mm，避免抑菌圈重叠。

　　用无菌针头或镊子将孔内琼脂挑出，每次使用后针头需火焰灼烧灭菌。

　　避坑要点：打孔时一次垂直插入，严禁转动，否则琼脂会出现裂缝，导致药液渗漏、抑菌圈不规则。

　　加样

　　用微量移液器将待测样品加入孔中，加至满而不溢出(常用加样量为50~200 μL，需保持各孔一致)。

　　培养与测量

　　盖好平皿，置37℃培养箱培养16~24小时。用游标卡尺测量抑菌圈直径(含孔径)，以肉眼可见无菌生长的外沿为界。

　　滤纸片法(Paper Disk Diffusion Method / K-B法)

　　菌悬液制备

　　挑取单菌落接种于液体培养基，37℃振荡培养至对数生长期，用比浊法调整至0.5麦氏单位(约1~2×10⁸ CFU/mL)。

　　涂布接种

　　用无菌棉签蘸取菌悬液，紧贴管壁旋转挤压去除多余液体，然后在琼脂平板表面均匀涂布，重复3次，每次旋转平板60°，z后沿边缘涂一圈。涂布后室温静置3~5分钟使表面干燥。

　　制备/选取药敏纸片

　　商品纸片：直接购买标准药敏纸片(直径6 mm)。

　　自制纸片：用打孔机将新华1号定性滤纸打成6 mm圆片，高压灭菌后干燥。加入定量药液浸透，37℃干燥后备用。

　　贴纸片

　　用无菌镊子夹取纸片轻放于琼脂表面，轻压使其与培养基紧密贴合。纸片间距≥24 mm，距皿边缘≥15 mm。90 mm平板一般贴5~6张。

　　避坑要点：纸片一旦接触琼脂不可移动，因部分药物会立即扩散，移动会导致结果不准。

　　培养与测量

　　贴好纸片后15分钟内将平板倒置放入35~37℃培养箱，培养16~18小时。从平板背面用游标卡尺测量抑菌圈直径(包含纸片直径)，读取z接近的整数毫米数。

　　两种方法对比

　　通用注意事项

　　培养基厚度：琼脂厚度应控制在4±0.5 mm，过厚或过薄均影响药物扩散速率。

　　菌液浓度：必须严格控制，浓度过高抑菌圈偏小，过低则抑菌圈偏大。

　　培养条件：平板需倒置培养，防止冷凝水滴落破坏抑菌圈。

　　对照设置：每次实验需设阳性对照(已知抑菌剂)和阴性对照(溶剂/无菌水)，确保实验体系有效。

　　平行实验：每组至少设3个重复，取平均值，提高结果可靠性。

　　测量时机：培养时间需统一，过早或过晚读取均影响抑菌圈大小。

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