动物肝脏组织透射电镜制样关键注意事项

　　动物肝脏组织透射电镜(TEM)制样的关键注意事项集中在：优先采用门静脉灌注固定、严格控制组织块尺寸(1 mm³)、离体后数秒内进入固定液、精确控制渗透压(320 mOsmol)、避免过度固定，并严格遵循六项质量评判标准。 具体操作要点与常见陷阱如下：

　　固定方式选择：灌注固定 vs 浸泡固定

　　肝脏TEM制样中，固定方式的选择是决定成败的首要因素。

　　门静脉灌注固定(金标准)

　　对于实验动物，经门静脉灌注固定是公认的z佳方法，优势包括：

　　实现全器官所有细胞的瞬时、同步固定，避免缺氧和自溶

　　固定液通过血管网络直接到达每个细胞，无需缓慢渗透

　　使用更低浓度的固定剂即可获得更好效果

　　血管和血窦开放，有利于后续锇酸、乙醇等试剂的渗透

　　可通过肝脏颜色变化(暗红→黄棕)和质地变化(软→硬如煮蛋)直观判断固定效果

　　关键参数：灌注流速约为1 mL/min/g肝脏重量;重力灌注水压约12 cmH₂O(对应生理门静脉压力);灌注时间约5分钟;针头选择：大鼠/小鼠用18–23G，兔/小型猪用12–13G。

　　楔形活检注射固定(替代方案)

　　当无法进行全肝灌注时(如临床活检)，可采用注射固定：用25G针头从多个方向向组织内注射1.5%戊二醛，直至组织变色变硬。此方法效果接近灌注固定，远优于单纯浸泡固定。

　　浸泡固定的局限

　　浸泡固定对肝实质细胞的超微结构仍可提供一定信息，但血窦和血窦内皮细胞的结构会被严重破坏，内皮窗孔(fenestrae)会消失。 若研究目标涉及血窦结构，必须采用灌注或注射固定。

　　组织块尺寸控制

　　这是容易被忽视却致命的环节。戊二醛分子量大、渗透速度慢，组织块过大将导致中心区域固定不完全。

　　TEM样品：切成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的小块

　　SEM样品：切成 1 mm × 1 mm × 5 mm 的条状

　　切片方向：用锋利刀片做锯切动作，不可施加压力，避免机械损伤

　　有方向性的结构(如胆管、血管)需沿伸展方向切成长条状(1 mm × 1 mm × 3 mm)

　　常见误区："切大一点更保险"——实际上，固定不透的样本即使后续切到目标位置，中心区域结构可能已经破坏，失去判读价值。

　　取材速度与时效

　　肝脏组织离体后自溶速度极快，从离体到进入固定液的时间应控制在数秒内。

　　所有试剂、器械提前4℃预冷

　　切割板上预先滴加戊二醛，操作尽量在碎冰上进行

　　离体后立即用生理盐水或PBS快速冲洗，随即投入固定液

　　戊二醛总固定时间(洗涤和锇酸后固定之前)不超过20分钟

　　固定液配制与渗透压

　　固定液的渗透压必须与组织匹配。动物组织的典型渗透压约为 320 mOsmol，缓冲液中需加入蔗糖等调节渗透压。

　　前固定液：1.5%戊二醛，溶于含蔗糖的0.067 mol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)

　　后固定液：1%锇酸四氧化物，溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液，4℃固定1小时

　　所有固定液应等渗、等温，避免温度休克和渗透压休克

　　渗透压不匹配的后果：高渗导致细胞皱缩，低渗导致细胞肿胀，均会产生假象。

　　后固定与增强对比度

　　戊二醛固定后，必须用缓冲液充分洗涤，去除残留戊二醛，避免与锇酸发生化学反应

　　锇酸后固定时，可加入1.5%铁氰化钾(还原型)，显著增强膜结构对比度，使线粒体嵴等细节更清晰

　　锇酸剧毒且易挥发，操作必须在通风橱中进行，使用密封玻璃容器

　　过度固定的危害

　　"周末固定"(将样品在戊二醛中存放数小时甚至数天)会导致：

　　细胞膜上出现大量游离囊泡(由磷脂衍生)

　　糖原颗粒聚集

　　细胞膜染色不良

　　糖原无法被染色

　　戊二醛固定时间应严格控制，固定完成后立即转入洗涤缓冲液。

　　脱水、包埋与超薄切片

　　梯度脱水：70%乙醇(15 min)→ 90%乙醇(15 min)→ 100%乙醇(30 min × 2)→ 环氧丙烷/Epon 1:1(过夜)→ 纯Epon(1 h)→ 包埋聚合(60℃过夜)

　　超薄切片：厚度约70 nm(银灰色)，使用钻石刀;切片颜色可辅助判断厚度——灰色偏薄，银色适中，金色偏厚

　　双重染色：醋酸铀酰(增强脂质和蛋白质对比度)+ 柠檬酸铅(增强蛋白质和糖原对比度);铅染色时须注意避免CO₂污染，防止生成不溶性碳酸铅白色沉淀

　　固定质量评判标准

　　良好的肝脏TEM制样应满足以下六项标准：

　　血窦开放，无塌陷

　　血窦内几乎无血浆和血细胞残留

　　同类细胞呈现一致的形态和密度

　　内皮窗孔(fenestrae)清晰可见

　　胆小管(尤其门管区)开放

　　肝实质细胞核呈圆形(椭圆形提示切片方向不正)

　　固定不良的标志：血窦塌陷且充满血细胞;相邻细胞明暗不一;同类细胞形态差异大;内皮窗孔消失;胆小管塌陷;细胞核不规则变形。

　　其他注意事项

　　麻醉选择：推荐使用戊巴比妥钠等兼具镇痛和肌松作用的麻醉剂，避免使用乙醚(无镇痛作用、易过量导致体温下降和休克，应激激素还会引起血管收缩影响灌注效果)

　　气泡排除：灌注管路中的气泡是灌注失败的主要原因之一，需定期检查管路，大型动物建议使用气泡捕获器

　　减压排气：灌注开始后立即切开下腔静脉使液体流出，避免压力积聚损伤内皮细胞和实质细胞

　　快速质控：将灌注固定后的肝组织薄片浸入蒸馏水，若变白则固定不充分(Fahimi试验)

　　样品运输：脱水至70%乙醇后可通过快递运输，固定后样品在缓冲液中4℃密封可保存数周

       来源：网络