MTT比色法实验原理及实验步骤

　　MTT比色法

　　MTT比色法(MTT Assay)是细胞生物学研究中经典、应用广泛的细胞存活与增殖检测方法之一，广泛用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性评估和生物活性因子检测等领域。

　　实验原理

　　MTT的全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴盐(噻唑蓝)，是一种黄色水溶性化合物。

　　其核心原理为：

　　活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中;

　　死细胞由于线粒体功能丧失，无法完成这一还原反应;

　　随后用DMSO(二甲基亚砜)溶解甲瓒结晶，在酶标仪上于490 nm或570 nm波长处测定吸光度(OD值);

　　在一定细胞数范围内，甲瓒生成量与活细胞数量成正比，从而间接反映细胞存活率。

　　实验步骤(以贴壁细胞为例)

　　细胞接种

　　收集对数生长期细胞，调整浓度后以每孔 1000～10000个细胞 接种至96孔板，每孔100 μL，边缘孔用无菌PBS填充。37°C、5% CO₂孵育至细胞贴壁。

　　药物处理

　　加入浓度梯度的待测药物(一般设5～7个梯度)，每孔100 μL，设3～5个复孔。继续孵育16～48小时。

　　MTT呈色

　　每孔加入 10～20 μL MTT溶液(5 mg/mL，终浓度约0.5 mg/mL)，继续培养 4小时。若药物与MTT有反应，需先离心弃去培养液，用PBS洗涤2～3遍后再加入含MTT的新鲜培养基。

　　溶解与比色

　　小心吸去孔内培养液，每孔加入 100～150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10分钟使甲瓒结晶充分溶解。用酶标仪在 490 nm(或570 nm，参比波长630 nm)处测定各孔吸光度。

　　对照组设置

　　调零孔：培养基 + MTT + DMSO(无细胞)

　　对照孔：细胞 + 培养基 + MTT + DMSO(不加药物)

　　数据处理

　　细胞存活率和抑制率的计算公式如下：

　　细胞存活率 = × 100%

　　抑制率 = × 100%

　　其中：

　　As：实验孔吸光度(含细胞、药物、MTT)

　　Ac：对照孔吸光度(含细胞、MTT，不含药物)

　　Ab：空白孔吸光度(含MTT，不含细胞和药物)

　　对于药物筛选，常通过GraphPad Prism等软件拟合剂量-反应曲线，计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

　　注意事项

　　细胞密度：铺板密度对结果影响很大，建议每孔约4000个细胞左右，给药时细胞密度控制在30%左右，孔底细胞需均匀分布。

　　MTT保存：MTT需避光保存，现用现配或分装后-20°C保存，避免反复冻融;若MTT溶液变为灰绿色则不可再使用。

　　吸光度范围：为保证线性关系，MTT吸光度z好控制在 0～0.7 范围内。

　　干扰因素：溶液中避免含有硫醇类化合物(会产生假阳性);培养基中的酚红也可能影响结果。

　　DMSO溶解：加DMSO前务必将孔内液体吸干净，否则甲瓒结晶难以充分溶解;振荡时避免产生气泡。

　　悬浮细胞：需先离心(1000转×10 min)后再吸弃上清，或使用WST-1替代MTT以简化操作。

       来源：网络