蛋白-小分子亲和力itc测定：实验设计与注意事项

　　ITC 测定蛋白 - 小分子亲和力的核心是C 值控制在 10–100、缓冲液严格匹配、样品无气泡 / 聚集、浓度精准定量;强 / 弱结合需用竞争 ITC，全程做对照扣除稀释热。

　　一、核心原理与适用范围

　　等温滴定微量热(ITC)通过直接测量小分子逐次滴入蛋白溶液的结合热，一次性获得KD(亲和力)、ΔH(焓变)、n(化学计量比)、ΔS(熵变)，无需标记、接近生理条件。

　　适用 KD：10 nM–100 μM(C=10–1000)。

　　不适用：极弱结合(KD>100 μM，C<1)、极强结合(KD<10 nM，C>1000)，需竞争 ITC。

　　二、实验设计(关键参数)

　　1. 浓度设计(C 值法则，关键)

　　C 值定义：C = n × [蛋白]/KD(n≈1，1:1 结合)。

　　z优：10 < C < 100 → 精准拟合 KD/ΔH/n。

　　可接受：1 < C < 1000。

　　不可接受：

　　C<1：曲线平坦、无拐点，KD 与 ΔH/n 耦合，需固定参数。

　　C>1000：曲线陡峭、过早饱和，只能测 ΔH/n，KD 不准。

　　浓度推荐(1:1 结合)

　　小分子浓度：7–25× 蛋白浓度(1:1)，确保滴定中后期饱和。

　　体积：样品池≥300 μL(202 μL 有效)，注射器≥100 μL(40 μL 有效)。

　　2. 缓冲液设计(必须严格匹配)

　　基础缓冲：20–50 mM Tris-HCl/PBS，pH 6.5–8.0(匹配蛋白稳定 pH)。

　　添加剂：

　　盐：50–150 mM NaCl(降低静电作用，减少聚集)。

　　还原剂：≤1 mM TCEP(替代 DTT/β-ME，基线更稳)。

　　助溶剂：DMSO≤5%(小分子难溶时，池液与注射器 DMSO 浓度完全一致)。

　　关键：池液与注射器缓冲完全相同(pH 差 < 0.05，电导一致)，否则稀释热会掩盖结合热。

　　3. 温度与滴定程序

　　温度：25℃(标准);弱结合可降温度(热信号放大);强结合可升温度。

　　滴定参数(ITC200)：

　　滴数：20–25 滴(首滴 0.5 μL，后续 2 μL)。

　　间隔：120–180 s(确保热信号回到基线)。

　　搅拌：300 rpm(充分混合，减少扩散热)。

　　4. 对照组设计(必做，扣除背景)

　　小分子滴缓冲：测稀释热(每滴热信号应恒定，后期扣除)。

　　缓冲滴蛋白：测蛋白稀释热 / 聚集热(基线漂移提示蛋白不稳定)。

　　热变性蛋白 + 小分子：验证特异性结合(变性后无结合热)。

　　三、样品准备(成败关键)

　　1. 蛋白样品

　　纯度：≥95%(SDS-PAGE/SEC-MALS)，无聚集(DLS 粒径均一)。

　　浓度：A280 定量(校正散射：A280 (真实)=A280−1.96×A330)，误差 < 5%。

　　状态：新鲜制备(4℃保存 < 24 h)，过滤(0.22 μm)、脱气(10 min，减少气泡)。

　　2. 小分子样品

　　纯度：≥98%(HPLC)，无杂质热信号。

　　溶解：水溶性直接溶缓冲;难溶用 DMSO 储备液(100 mM)，再稀释至缓冲(DMSO 浓度与池液一致)。

　　浓度：精准称量或 HPLC 定量，误差 < 3%(注射器浓度误差直接影响 KD/ΔH)。

　　四、实验操作注意事项

　　无气泡：样品装填缓慢，避免气泡(气泡会导致尖峰、基线不稳)。

　　基线稳定：平衡至热流漂移 < 0.1 ncal/s(通常 30–60 min)。

　　首滴丢弃：首滴体积小、扩散快，数据无效，拟合时删除。

　　避免污染：注射器 / 样品池用缓冲冲洗 3 次，防止交叉污染。

　　蛋白活性：避免反复冻融、高温、剧烈搅拌(易聚集失活)。

　　五、数据分析要点

　　模型选择：1:1 结合用单位点模型;多位点 / 协同结合用双位点 / 协同模型。

　　拟合质量：

　　残差随机分布(无趋势)。

　　χ² z小(<10)，参数误差 < 10%。

　　n=0.9–1.1(1:1 结合，偏离提示非特异性或聚集)。

　　热力学参数关联：ΔG=−RTlnKD=ΔH−TΔS，可判断结合驱动力(焓驱动 / 熵驱动)。

       来源：网络