抗体 - 抗原亲和力测定常用方法

　　一、基本概念

　　抗体(Ab)+ 抗原(Ag)可逆结合：

　　Ab+Ag⇌Ab−Ag

　　解离常数：

　　KD​越小 = 亲和力越强

　　单位：pM、nM、μM

　　二、常用测定方法(实验室常用 6 种)

　　1. 酶联免疫吸附法 ELISA(常规、低成本)

　　原理

　　抗原包被微孔板，抗体梯度稀释结合，显色做剂量反应曲线，用EC50 近似表观KD​。

　　优点：便宜、高通量、不需高端仪器

　　缺点：属于表观亲和力，不是真实热力学KD​，受包被、洗涤影响大

　　适用：抗体初筛、多克隆 / 杂交瘤上清批量筛选

　　2. 生物层干涉法 BLI(Octet 主流)

　　原理

　　传感器探针固化抗原 / 抗体，实时检测结合、解离全过程，拟合得到  。

　　优点：无需微流控、操作简单、可测粗样品、速度快、结果接近真实动力学

　　缺点：精度略低于 SPR

　　适用：单抗、重组抗体亲和力常规检测(药企常用)

　　3. 表面等离子体共振 SPR(行业金标准)

　　原理

　　芯片表面固定配体，流动相进样不同浓度分析物，实时动态监测结合与解离，计算动力学常数和KD​。

　　优点：精度z高、可做精细动力学分析、可用于申报材料

　　缺点：仪器和耗材贵、样品纯度要求高

　　适用：候选抗体确证、新药申报、机制研究

　　4. 微量热泳动 MST

　　原理

　　溶液中分子在温度梯度下迁移速率随结合后分子大小、构象、水化层变化，无需固定化直接测溶液中亲和力。

　　优点：不用包被、接近天然状态、样品用量少、适合膜蛋白、难固定抗原

　　缺点：需专用仪器

　　5. 流式细胞术 FACS

　　原理

　　抗原表达在细胞表面，抗体梯度浓度孵育，荧光强度拟合饱和结合曲线，计算细胞表面表观KD​。

　　优点：贴近细胞膜天然状态

　　适用：抗病毒抗体、靶向细胞表面抗原抗体

　　6. 平衡透析法 经典热力学方法

　　原理

　　半透膜隔开抗体与抗原，小分子抗原可自由扩散，达平衡后测两侧浓度，直接计算KD​。

　　优点：完全热力学平衡、无固定化干扰

　　缺点：操作繁琐、耗时长、通量低

　　适用：基础研究、校准其他方法

　　三、各方法特点快速对比

　　四、实验通用关键要点

　　抗体 / 抗原纯度尽量 ≥90%，杂质严重影响KD​;

　　缓冲液统一(常用 PBS pH7.4)，pH、盐离子显著影响亲和力;

　　浓度梯度至少 6～8 个点，覆盖预估KD​的 0.1～10 倍范围;

　　避免抗原高密度包被，防止多价结合造成亲和力虚高;

　　必须做空白、对照、平行样，保证拟合可靠。

　　五、选用建议

　　大批量初筛 → ELISA

　　常规精准测亲和力 → BLI(Octet)

　　发高水平论文 / 新药申报 → SPR

　　膜蛋白、难固定抗原 → MST

　　细胞表面靶点抗体 → FACS

       来源：网络