96孔板MIC测定步骤和判定方法

　　96孔板MIC(z低抑菌浓度)测定，也称为微量肉汤稀释法，是目前临床微生物检验和药物研发中常用的定量药敏试验方法。

　　相比传统的试管法，96孔板法具有微量、快速、高通量的优势，能同时检测多种药物对多种菌株的抑制效果。

　　下面是操作步骤和判定方法：

　　1. 实验准备与核心试剂

　　在开始之前，你需要准备好以下关键材料：

　　96孔板：通常使用无菌的聚苯乙烯平底或U型底板。

　　培养基：一般选用Mueller-Hinton (MH) 肉汤。对于苛养菌(如链球菌、嗜血杆菌)，需添加特定的补充剂(如5%脱纤维马血或HTM肉汤)。

　　抗菌药物：需准确称量并配制成高浓度的贮存液(如1280 μg/mL)，过滤除菌后分装保存。

　　菌液：待测菌株需活化，并调整浓度至0.5麦氏比浊度(约 1×1081×108 CFU/mL)。

　　2. 详细操作步骤

　　第一步：药物稀释(建立浓度梯度)

　　这是实验关键的一步，通常采用二倍稀释法。

　　加液：除第1孔外，向96孔板的第2至第11孔(或根据需要设定)每孔加入 100 μL 无菌MH肉汤。

　　加药：在第1孔和第2孔中各加入 100 μL 配制好的抗菌药物溶液(浓度通常为预期z高浓度的2倍，或直接加入高浓度药液后进行连续稀释)。

　　梯度稀释：

　　用移液器反复吹吸混匀第1孔(z高浓度孔)。

　　从第1孔吸取 100 μL 液体加入第2孔，混匀。

　　从第2孔吸取 100 μL 加入第3孔，混匀。

　　以此类推，直到第10孔或第11孔。

　　注意：z后一孔(如第11孔)混匀后需吸出 100 μL 弃去，使孔内体积保持 100 μL。第12孔通常不加药，作为生长对照。

　　第二步：接种菌液

　　菌液制备：将待测菌株配制成0.5麦氏单位悬液，并用MH肉汤进行 1:100 稀释(或1:50，视具体标准而定)，使z终接种量达到 5×1055×105 CFU/mL。

　　加样：向上述含药孔(第1-11孔)及对照孔(第12孔)中各加入 100 μL 稀释后的菌液。

　　此时，孔内总体积为200 μL，药物浓度被稀释一倍，形成z终的测试梯度。

　　第三步：设置对照

　　为了确保实验结果有效，必须设置以下对照：

　　阳性对照(生长对照)：含菌液 + 不含药物(通常为第12孔)。用于确认细菌在无药环境下能正常生长。

　　阴性对照(空白对照)：含培养基 + 不含菌液 + 不含药物。用于确认培养基无菌，无污染。

　　溶剂对照(如药物用DMSO溶解)：确认溶剂本身对细菌无抑制作用。

　　第四步：培养

　　盖上板盖(防止蒸发，可加封板膜)，置于 35℃ ± 2℃ 恒温培养箱中。

　　一般细菌培养 16-20小时;生长缓慢的细菌(如链球菌)需培养20-24小时。

　　3. 结果读取与判定

　　培养结束后，通过以下方式判定MIC值：

　　肉眼观察法(常用)

　　观察指标：观察孔内液体的浑浊度。

　　判定标准：

　　浑浊：表示有细菌生长(+)。

　　清亮：表示细菌生长被抑制(-)。

　　MIC定义：肉眼观察无细菌生长(液体清亮)的z低药物浓度孔，即为该药物的MIC值。

　　仪器读数法(更客观)

　　酶标仪(OD600)：使用酶标仪测定各孔在600nm波长下的吸光度(OD值)。通常以OD值低于某个阈值(如阳性对照的10%或低于空白对照3个标准差)判定为无生长。

　　TTC显色法：加入TTC(氯化三苯基四氮唑)显色剂，活细菌会将无色的TTC还原为红色物质。

　　红色：有菌生长。

　　无色：无菌生长(MIC孔)。

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