纸片扩散法测定抗菌活性实验步骤

　　纸片扩散法，也称为K-B法(Kirby-Bauer法)，是测定物质抗菌活性的经典定性或半定量方法。其原理是将含有抗菌物质的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，抗菌物质在琼脂中扩散形成浓度梯度，抑制细菌生长，从而在纸片周围形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映了该物质对测试菌的抑制能力。

　　下面是实验步骤：

　　实验准备

　　1. 主要试剂与材料

　　培养基：Mueller-Hinton (MH) 琼脂是药敏试验的标准培养基。对于苛养菌(如链球菌)，需使用添加5%脱纤维羊血的MH琼脂。

　　测试菌株：常用标准菌株包括大肠埃希菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)等。

　　抗菌物质载体：直径为6mm的无菌定性滤纸片。

　　稀释液：无菌生理盐水或MH肉汤。

　　对照品：

　　阳性对照：已知浓度的标准抗生素纸片。

　　阴性对照：浸有无菌水或相应溶剂的纸片。

　　2. 仪器设备

　　超净工作台

　　恒温培养箱(35℃±2℃)

　　比浊仪或0.5麦氏比浊管

　　无菌棉拭子

　　无菌镊子

　　游标卡尺

　　详细操作步骤

　　1. 菌悬液制备

　　从新鲜培养的平板上挑取3-5个形态一致的单个菌落。

　　接种于无菌生理盐水或MH肉汤中，充分混匀。

　　使用比浊仪或比浊管，将菌悬液浓度调整至 0.5麦氏单位(约 1.5×1081.5×108 CFU/mL)。此步骤需在15分钟内完成接种。

　　2. 接种平板

　　用无菌棉拭子浸入调整好的菌悬液中，在试管壁上挤压去除多余液体。

　　用棉拭子在MH琼脂平板表面均匀涂布，重复涂布3次，每次将平板旋转约60度，确保菌液均匀分布。

　　z后用棉拭子沿平板内壁涂抹一周。

　　涂布好的平板在室温下放置3-5分钟，使琼脂表面稍干，以便更好地吸收药液。

　　3. 放置药敏纸片

　　用无菌镊子夹取含抗菌物质的纸片，贴于已接种细菌的琼脂表面。

　　用镊子尖端轻压纸片，确保其与琼脂表面完全接触。

　　布局要求：

　　纸片中心间距不小于 24 mm。

　　纸片中心距平板边缘不小于 15 mm。

　　对于直径90mm的标准平板，通常放置不超过 5-6 张纸片。

　　注意：纸片一旦接触琼脂表面便不可移动，因为药物会立即开始扩散。

　　4. 孵育

　　贴好纸片后，应在15分钟内将平板倒置放入培养箱。

　　在 35℃±2℃ 条件下培养 16-18小时。

　　对于某些特殊细菌(如链球菌、嗜血杆菌)，需在含5% CO₂的环境中培养。

　　结果测量与判定

　　1. 测量抑菌圈

　　培养结束后，取出平板，置于黑色不反光背景上。

　　使用游标卡尺，从平板背面测量完全抑制细菌生长区域的直径(包括纸片直径)，读数精确到毫米(mm)。

　　对于不规则的抑菌圈，应测量其z大和z小直径，取平均值。

　　2. 结果判定

　　抑菌圈的大小直接反映了抗菌活性的强弱。对于日化产品、消毒剂和抗菌材料，通常采用以下标准进行初步判定：

　　注意：在临床药敏试验中，判定标准(敏感、中介、耐药)需根据具体的抗生素和细菌种类，查阅CLSI等权威机构发布的标准化表格，不同组合的折点值各不相同。

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