外泌体扫描电镜表征：样品要求与成像方案

　　外泌体的扫描电镜(SEM)表征，核心优势在于能呈现其三维表面形貌，这正好弥补了透射电镜(TEM)主要观察二维截面或负染色轮廓的不足。

　　不过，外泌体是纳米级、非导电的生物样品，要获得高质量的图像，必须在样品制备和成像方案上遵循一套严格的流程。

　　样品要求：纯度与浓度是关键

　　高质量的样品是成功成像的第一步。

　　样品类型：可以是预纯化后的外泌体悬液，也可以是细胞培养上清、血清、血浆等生物液体(后者通常需要服务商先进行分离纯化)。

　　样品纯度：样品应尽可能纯净，避免混杂大量的蛋白质聚合物、细胞碎片等杂质。这些杂质会与外泌体竞争吸附到基底上，并干扰成像。建议通过超速离心或试剂盒等方法进行纯化。

　　样品浓度：浓度至关重要。浓度过低，视野中很难找到外泌体;浓度过高，则会导致颗粒严重堆积、重叠，无法分辨单个颗粒的形态。

　　液体样品：通常需要提供 100-200 μL 的体积。

　　浓度建议：虽然没有统一标准，但一个合适的浓度能保证在电镜视野下有足够多且分散良好的颗粒。如果不确定，可以提前通过纳米颗粒追踪分析(NTA)等方法测定浓度。

　　缓冲液：尽量避免使用磷酸盐缓冲液(PBS)或三羟甲基氨基甲烷(Tris)等含有高浓度盐分的缓冲液。盐分在干燥过程中会结晶，这些盐结晶会严重干扰成像，甚至损坏仪器。推荐将样品置换到超纯水或低浓度的非结晶性缓冲液中。

　　运输与保存：样品应根据其保存条件进行运输。例如，外泌体样品通常需要干冰运输，以保证其在运输过程中的活性和完整性。

　　成像方案：从制备到观察

　　外泌体SEM成像方案主要包含样品制备、仪器成像和数据分析三个环节。

　　1. 样品制备流程

　　这是关键的一步，目的是将柔软、不导电的外泌体固定在基底上，并使其能够被电子束稳定成像。

　　基底选择与固定：将外泌体样品吸附到特定的基底上，如硅片、盖玻片或带有特殊涂层的载网。为了让外泌体在后续的清洗步骤中不脱落，通常会使用 2.5%戊二醛 等固定剂进行温和固定，以保持其形态。

　　清洗与干燥：用去离子水或缓冲液轻柔地清洗基底，去除未吸附的杂质和盐分，然后进行梯度干燥(如临界点干燥或自然晾干)，避免表面张力破坏外泌体结构。

　　喷金处理(导电涂层)：由于外泌体本身不导电，在电子束照射下会产生电荷积累(即“充电效应”)，导致图像模糊或扭曲。因此，必须在样品表面喷镀一层极薄(通常几纳米)的导电金属膜，如金(Au)、铂(Pt)或金钯合金(Au/Pd)。

　　2. 仪器成像与参数设置

　　加速电压：通常使用较低的加速电压(如 1-5 kV)，以获得更好的表面细节和更高的信噪比，同时减少对样品的损伤。

　　放大倍数：外泌体尺寸在30-150 nm之间，因此需要较高的放大倍数(通常在 50,000倍至100,000倍 或更高)才能清晰观察。

　　工作距离：选择合适的工作距离，以平衡图像的分辨率和景深。

　　3. 数据分析与结果解读

　　形态评估：观察外泌体的整体形态，通常为球形或近球形囊泡。

　　尺寸分布：通过测量图像中大量外泌体的直径，统计其尺寸分布。

　　表面特征：分析外泌体表面的光滑度、粗糙度以及是否存在特殊的表面蛋白或结构。

　　聚集状态：评估样品中外泌体的分散情况，是否存在严重的团聚现象。

　　SEM、TEM、Cryo-EM：如何选择?

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