单克隆抗体亲和力测定方法

　　单克隆抗体(mAb)亲和力测定 (Affinity Measurement) 是生物药研发、质量控制及临床前研究中的核心环节。亲和力(Affinity)描述了抗体抗原结合位点(Paratope)与抗原表位(Epitope)之间结合的紧密程度，通常用平衡解离常数 ( KDKD​ ) 来表示。 KDKD​ 值越小，亲和力越高。

　　对于治疗性单抗，理想的 KDKD​ 值通常在 pM (皮摩尔) 到 nM (纳摩尔) 级别(例如 10−910−9 到 10−1210−12 M)。

　　主流测定方法

　　1. 表面等离子体共振 (SPR) —— 行业金标准

　　代表仪器：Cytiva (GE) Biacore 系列。

　　原理：将抗原或抗体固定在芯片表面，流过另一种分子。通过检测芯片表面折射率的变化(响应单位 RU)实时监测结合和解离过程。

　　优点：

　　无标记 (Label-free)：无需荧光或放射性标记，保持分子天然状态。

　　实时动力学：可直接测得 konkon​ 、 koffkoff​ 和 KDKD​ 。

　　灵敏度高：可检测 pM 级别的亲和力。

　　样品消耗少。

　　缺点：

　　固定化效应：分子固定在芯片上可能改变构象或产生空间位阻(Steric Hindrance)。

　　质量传输限制 (Mass Transport Limitation)：如果结合太快，扩散速度跟不上，会导致数据失真。

　　成本高：芯片和仪器昂贵。

　　适用场景：先导化合物筛选、候选分子确证、CMC 阶段的关键质量属性 (CQA) 放行。

　　2. 生物膜干涉技术 (BLI) —— 高通量首选

　　代表仪器：Sartorius Octet 系列。

　　原理：基于光纤探针尖端的生物膜层厚度变化引起的光干涉位移。将分子固定在探针上，浸入样品孔中。

　　优点：

　　操作简便：类似 ELISA 的“ Dip-and-Read ”模式，无需微流路。

　　高通量：可同时运行 8-96 个样品。

　　抗脏污能力强：对粗提液(如细胞培养上清)耐受性好，无需纯化即可初筛。

　　无质量传输限制：溶液是静止的，靠探针移动，减少了流体动力学干扰。

　　缺点：

　　灵敏度略低于高端 SPR(但在 nM-pM 级完全够用)。

　　探针是一次性的，长期运行成本需考量。

　　基线漂移有时比 SPR 大。

　　适用场景：早期杂交瘤上清筛选、表位 binning 分析、快速动力学表征。

　　3. 等温滴定量热法 (ITC) —— 溶液态热力学金标准

　　代表仪器：Malvern MicroCal。

　　原理：直接测量分子结合过程中释放或吸收的热量。

　　优点：

　　完全溶液态：无固定化，z接近生理环境，无空间位阻假象。

　　全热力学参数：除了 KDKD​ ，还能测焓变 ( ΔHΔH )、熵变 ( ΔSΔS ) 和化学计量比 ( nn )，揭示结合驱动力(氢键 vs 疏水作用)。

　　缺点：

　　样品消耗量大：需要较高浓度和较大体积(毫克级)。

　　通量低：一次实验耗时较长。

　　灵敏度限制：对于超高亲和力 ( KD<10pMKD​<10pM ) 或极低亲和力 ( KD>10μMKD​>10μM ) 难以准确测定。

　　适用场景：机制研究、验证 SPR/BLI 结果、小分子药物与蛋白结合研究。

　　4. 酶联免疫吸附试验 (ELISA) / 细胞流式 (FACS) —— 功能性/相对亲和力

　　原理：

　　ELISA：通过不同浓度抗体结合后的信号强度拟合曲线，计算 EC50EC50​ 。

　　FACS：在细胞表面表达抗原，滴定抗体，检测荧光强度。

　　特点：

　　测得的是 EC50EC50​ (半z大有效浓度)，不是真正的 KDKD​ 。

　　EC50EC50​ 受亲和力、价态(IgG 是二价)、抗原密度、孵育时间等多种因素影响。

　　无法区分 konkon​ 和 koffkoff​ 。

　　适用场景：功能性验证、细胞水平结合能力评估、低成本初筛。不能替代 SPR/BLI 作为申报资料中的亲和力数据。

       来源：网络