在SPR(表面等离子体共振)实验中，非特异性结合(Non-Specific Binding, NSB)
是常见且令人头疼的问题之一。它会导致基线漂移、结合信号虚高、动力学拟合失败，甚至掩盖真实的相互作用信号。
NSB通常源于分析物(Analyte)与芯片表面基质(如葡聚糖)、封闭剂、或已固定的配体(Ligand)发生了非目标性的疏水或静电相互作用。
核心解决方案
1. 优化运行缓冲液(Running Buffer)—— 常用且有效
通过调整缓冲液成分来屏蔽疏水或静电作用。
增加表面活性剂(针对疏水作用)：
添加 Tween-20：这是标准操作。浓度从标准的 0.005% 提升至 0.01% - 0.05%。
注意：过高浓度可能导致气泡或影响某些蛋白活性。
更换表面活性剂：如果Tween-20无效，尝试 P20 (Biacore专用)、Pluronic F-68，或更温和的非离子型去垢剂。
针对极度疏水样品(如ADC、膜蛋白)：可尝试添加微量 CHAPS (0.1-0.5 mM) 或 Octyl
glucoside，但需注意再生难度。
调整离子强度(针对静电作用)：
提高盐浓度：将NaCl浓度从标准的150 mM提升至 300 mM - 500 mM。高盐可以屏蔽电荷相互作用，减少静电吸附。
注意：高盐可能影响生物活性，需验证。
添加竞争性抑制剂/载体蛋白：
添加BSA或Casein：在缓冲液中加入 0.1% - 1% BSA (牛血清白蛋白) 或 Casein
(酪蛋白)。它们会优先占据芯片表面的非特异位点。
警告：如果你的配体是抗BSA抗体或样品中含有BSA，此法不可用。
添加游离葡聚糖：如果是CM5芯片(葡聚糖基质)，可在缓冲液中加入少量游离羧甲基葡聚糖，竞争结合位点。
调整pH值：
改变缓冲液pH(例如从7.4调至6.0或8.0)，改变蛋白表面电荷分布，减少静电吸附。需确保蛋白在此pH下稳定。
2. 优化芯片表面与封闭策略(Surface Chemistry)
如果缓冲液优化无效，说明芯片表面本身有问题。
加强封闭(Blocking)：
在固定配体后，使用更高浓度的 乙醇胺(Ethanolamine) 进行封闭(例如 1 M, pH 8.5，延长封闭时间)。
尝试交替封闭：先用乙醇胺，再用 BSA 或 Casein 溶液流过表面进行二次封闭。
更换芯片类型(针对疏水/带电样品)：
CM5芯片(羧甲基葡聚糖)：常用，但带负电且有疏水骨架。
C1芯片(平坦疏水表面)：无葡聚糖层，适合疏水小分子或膜蛋白，减少立体位阻和葡聚糖吸附。
CM3芯片(低密度葡聚糖)：减少葡聚糖链长，降低非特异吸附空间。
Series S Sensor Chips
(NTA/SA)：如果是His标签蛋白，使用NTA芯片捕获;如果是生物素化蛋白，使用SA(链霉亲和素)芯片。这些表面通常比共价偶联的CM5更“干净”。
亲水改性芯片：某些厂家提供经过特殊亲水涂层的芯片，专门用于高疏水样品。
改变固定化取向：
如果是共价偶联，尝试改变配体的固定方向(例如通过氨基偶联改为通过巯基偶联，或通过生物素-链霉亲和素捕获)，暴露出不同的表面区域，可能减少与分析物的非特异接触面。
3. 样品预处理(Sample Preparation)
分析物本身的状态往往是NSB的根源。
离心过滤(必须做!)：
样品中微小的聚集体是导致NSB和假阳性信号的主要原因。
操作：上机前，务必将样品在 4°C下高速离心 (14,000 - 20,000 rpm, 10-15 min)，并使用 0.22 μm 或 0.1
μm 滤膜 过滤上清液。
稀释缓冲液匹配：
确保样品稀释缓冲液与运行缓冲液完全一致(包括pH、盐、表面活性剂、DMSO浓度等)。任何微小的折射率差异(Bulk
Effect)都会被误读为结合信号。
降低样品浓度：
NSB通常与浓度成正比。尝试降低分析物浓度，看信号是否成比例下降。如果低浓度下信噪比依然很差，说明NSB严重。
4. 数据处理与实验设计修正
如果物理化学方法都无法完全消除NSB，可以通过实验设计来扣除。
双参考扣除法(Double Referencing)：
这是Biacore等仪器的标准数据处理方法。
步骤：
减去 空白通道(Reference Cell) 的信号(扣除芯片基质NSB)。
再减去 零浓度样品(Buffer injection) 的信号(扣除系统漂移和进样误差)。
效果：能消除大部分线性NSB，但如果NSB呈现复杂的结合/解离曲线，扣除效果有限。
使用竞争抑制剂验证：
在样品中加入过量的游离配体或已知抑制剂。如果信号消失，说明是特异性结合;如果信号依然存在，那部分就是NSB。
来源：网络
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更新时间：2026-03-18