蛋白免疫印迹(Western Blot)的操作流程是什么？

　　蛋白免疫印迹(Western Blot，简称 WB) 是分子生物学和生物化学中用于检测特定蛋白质在复杂混合物中的存在、分子量大小及相对表达量的“金标准”技术。

　　它结合了聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的高分辨率分离能力和抗原 - 抗体反应的高度特异性。

　　标准操作流程 (Step-by-Step)

　　第一步：样品制备 (Sample Preparation)

　　裂解：使用 RIPA 等裂解液提取总蛋白。关键点：必须加入蛋白酶抑制剂(防止降解)和磷酸酶抑制剂(若检测磷酸化蛋白)。

　　变性：加入上样缓冲液(Loading Buffer，含 SDS 和还原剂如 DTT/β-ME)，95-100°C 煮沸 5-10 分钟。

　　作用：破坏二级/三级结构，使蛋白带上负电荷并线性化，确保按分子量分离。

　　定量：使用 BCA 或 Bradford 法测定蛋白浓度，确保上样量一致(通常 20-50 μg/孔)。

　　第二步：SDS-PAGE 电泳 (Electrophoresis)

　　浓缩胶 (Stacking Gel, 5%)：将样品压缩成一条窄带，提高分辨率。

　　分离胶 (Separating Gel, 8%-15%)：根据目标蛋白分子量选择浓度(小分子用高浓度胶，大分子用低浓度胶)。

　　运行：恒压电泳，直到溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。

　　第三步：转膜 (Transfer)

　　方法：湿转(效率高，适合大多数蛋白)或半干转(速度快)。

　　膜的选择：

　　PVDF 膜：结合能力强，机械强度高，需先用甲醇活化。适合低丰度蛋白。

　　NC 膜 (硝酸纤维素)：背景低，无需甲醇活化，但较脆。适合高丰度蛋白。

　　关键：确保“三明治”结构(阴极 - 海绵 - 滤纸 - 胶 - 膜 - 滤纸 - 海绵)紧密且无气泡，电流方向正确(蛋白从负极向正极移动)。

　　第四步：封闭 (Blocking)

　　目的：遮盖膜上的非特异性结合位点。

　　试剂：5% 脱脂奶粉(最常用，便宜)或 5% BSA(若检测磷酸化蛋白或糖蛋白，必须用 BSA，因为奶粉中含有酪蛋白磷酸化和生物素，会干扰)。

　　时间：室温 1 小时或 4°C 过夜。

　　第五步：抗体孵育 (Antibody Incubation)

　　一抗 (Primary Antibody)：

　　稀释液：TBST + 封闭剂。

　　条件：4°C 摇床过夜(特异性最好)或室温 1-2 小时。

　　注意：一抗的特异性决定实验成败。

　　洗膜：TBST 洗 3 次，每次 5-10 分钟，去除未结合的一抗。

　　二抗 (Secondary Antibody)：

　　选择与一抗种属匹配的 HRP 标记二抗(如抗兔 IgG-HRP)。

　　条件：室温孵育 1 小时。

　　洗膜：TBST 洗 3-4 次，彻底去除未结合的二抗(降低背景的关键)。

　　第六步：显影与成像 (Detection)

　　ECL 发光：将 A 液和 B 液混合后滴加到膜上，HRP 催化底物发光。

　　成像：使用化学发光成像仪或 X 光胶片曝光。

　　内参对照：必须同时检测看家蛋白(如 GAPDH, β-Actin, Tubulin)，以校正上样误差和转膜效率，进行归一化分析。

       来源：网络