病原微生物宏基因组测序工作流程

　　病原微生物宏基因组测序 (Pathogen Metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS) 是一种无需培养、直接对临床样本(如血液、肺泡灌洗液、脑脊液等)中的所有核酸(DNA 或 RNA)进行高通量测序的技术。

　　它能够一次性检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等所有类型的病原体，是目前解决疑难危重感染、新发突发传染病以及混合感染诊断的“终极武器”。

　　标准工作流程 (Workflow)

　　1. 样本采集与前处理

　　样本类型：无菌体液(脑脊液、胸腹水、血液)、呼吸道深部样本(肺泡灌洗液 BALF)、组织活检等。BALF 和脑脊液是阳性率z高的样本类型。

　　核酸提取：关键在于高效裂解(特别是革兰氏阳性菌、真菌孢子、结核分枝杆菌等有厚细胞壁的微生物)和去除宿主。

　　DNA vs RNA：

　　DNA 测序：检测细菌、真菌、DNA 病毒、寄生虫。

　　RNA 测序 (需逆转录)：检测 RNA 病毒(如流感、新冠、登革热)，且由于 RNA 在死菌中降解快，更能反映活动性感染。目前常采用 DNA+RNA 双测序 以覆盖z全谱。

　　2. 文库构建与测序

　　建库：片段化、末端修复、加接头、PCR 扩增(或无扩增建库以减少偏好性)。

　　测序平台：

　　Illumina (短读长)：主流选择。准确率高 (>99.9%)，适合物种鉴定和耐药基因分析。

　　Nanopore/PacBio (长读长)：读长可达 kb 级别，有助于组装完整基因组、区分高度同源菌株、直接检测甲基化修饰(辅助菌种鉴定)，但错误率相对较高(正在改善)。

　　3. 生信分析与解读 (关键环节)

　　数据库质量：数据库的完整性(是否包含罕见菌、新发病毒)和洁净度(是否含污染序列)直接决定结果准确性。

　　判读标准：不能仅看 Reads 数。需综合考量：

　　特异性序列数：比对到该物种特有区域的序列数。

　　基因组覆盖度：是否覆盖了基因组的多个区域(避免单点假阳性)。

　　背景噪音：该物种是否为常见环境污染物(如痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌)。

　　临床一致性：患者症状、影像学、其他检验结果是否支持。

       来源：网络