考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

　　考马斯亮蓝法(Bradford法) 是目前生物化学和分子生物学实验室中常用、快速的蛋白质浓度测定方法之一。它基于染料与蛋白质结合后发生颜色变化的原理。

　　标准操作流程 (Standard Protocol)

　　A. 试剂准备

　　Bradford 工作液： commercially available (市售) 或自制(含磷酸、乙醇、考马斯亮蓝G-250)。注意：工作液需避光保存，若有沉淀需过滤。

　　标准蛋白：常用牛血清白蛋白 (BSA)，浓度通常为 1-2 mg/mL。也可使用免疫球蛋白 (IgG)，但需注意不同蛋白的标准曲线斜率不同。

　　待测样本：需稀释至线性范围内。

　　B. 步骤 (以96孔板微量法为例，适合高通量)

　　制备标准曲线：

　　将BSA标准品梯度稀释(例如：0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL，或者更低浓度范围 0-20 μg/mL 用于微量法)。

　　加样：

　　取 96 孔板，每孔加入 5-10 μL 的标准品或待测样本(建议做3个复孔)。

　　每孔加入 200-250 μL Bradford 工作液。

　　比例参考：样本:试剂 = 1:20 到 1:50。

　　混匀与孵育：

　　轻轻振荡混匀，避免产生气泡。

　　室温(20-25℃)静置 5-10 分钟。

　　注意：颜色在2-5分钟内达到稳定，可维持约1小时，但建议在30分钟内完成读数。

　　检测：

　　使用酶标仪在 595 nm 波长下测定吸光度(OD595)。

　　若无酶标仪，可用分光光度计(需加大样本量至100μL + 5mL试剂)。

　　计算：

　　绘制标准曲线(OD值 vs 浓度)，拟合线性回归方程 ( y=ax+b )。

　　代入样本OD值计算浓度，并乘以稀释倍数。

       来源：网络