GST融合蛋白纯化技术操作流程

　　GST融合蛋白纯化 (GST Fusion Protein Purification) 是利用谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase, GST)与谷胱甘肽(Glutathione, GSH)之间高亲和力、特异性结合的原理，从复杂细胞裂解液中分离目标蛋白的经典亲和层析技术。

　　该技术具有操作简便、条件温和、纯度高、可溶性标签促进折叠等优点，是实验室常用的蛋白纯化手段之一。

　　标准操作流程 (SOP)

　　第一步：蛋白表达与细胞收集

　　转化质粒至BL21，涂板过夜。

　　挑单克隆接种至LB培养基，37℃振荡培养至OD600 ≈ 0.6-0.8。

　　诱导：加入IPTG (终浓度0.1-1.0 mM)，降低温度至16-25℃诱导表达12-16小时(低温有助于提高可溶性)。

　　收集：4℃离心 (5000 rpm, 10 min) 收集菌体，PBS洗涤一次，弃上清。菌体沉淀可-80℃保存。

　　第二步：细胞裂解 (关键步骤)

　　重悬菌体于预冷的裂解缓冲液 (每1g湿菌体约5-10 mL缓冲液)。

　　加入溶菌酶，冰浴30 min。

　　超声破碎：

　　功率：30%-40% (避免过热变性)。

　　模式：开3s，停5s，总时间10-15 min，直至溶液变清亮不粘稠。

　　注意：全程冰浴操作!

　　离心：4℃，12,000-15,000 rpm，离心30 min。

　　上清液：含可溶性GST融合蛋白(目标)。

　　沉淀：包涵体(若目标蛋白在此，需变性纯化，见后文)。

　　第三步：亲和层析 (重力柱或AKTA系统)

　　方法A：重力柱法 (实验室小规模常用)

　　平衡：用5-10倍柱体积 (CV) 的结合缓冲液平衡Glutathione Sepharose树脂。

　　上样：将澄清的上清液缓慢流过柱子，流速控制在0.5-1 mL/min，让蛋白充分结合。收集流穿液 (Flow-through) 以备检测。

　　洗涤：用10-20 CV的结合缓冲液洗涤柱子，直至流出液的A280降至基线(去除非特异性吸附的杂蛋白)。

　　技巧：若杂蛋白多，可用含300-500 mM NaCl或0.1% Triton X-100的缓冲液加强洗涤。

　　洗脱：

　　加入5-10 CV的洗脱缓冲液 (含10-20 mM GSH)。

　　分段收集洗脱峰 (每1-2 mL一管)。

　　可选：为了节省GSH，可采用“分步洗脱”或“静态孵育洗脱”(加入少量洗脱液，封闭柱子静置10-30 min，再放出)。

　　再生与保存：用5 CV 0.1 M NaOH清洗柱子去除残留蛋白，再用结合缓冲液平衡，z后保存在20%乙醇中4℃备用。

　　方法B：磁珠法 (高通量/微量)

　　取适量Glutathione Magnetic Beads，磁力架吸附，弃保存液。

　　用结合缓冲液洗涤磁珠2次。

　　将裂解上清液与磁珠混合，4℃旋转孵育1-2小时。

　　磁力架吸附，弃上清。

　　用预冷结合缓冲液洗涤磁珠3-5次(每次彻底吸干)。

　　加入洗脱缓冲液，室温或4℃孵育10-20 min，磁力架吸附，收集上清即为纯化蛋白。

　　第四步：分析与标签切除 (可选)

　　SDS-PAGE检测：取上样流穿、洗涤液、各洗脱组分跑胶，评估纯度和回收率。

　　标签切除：

　　若载体含蛋白酶切位点(如Thrombin, PreScission, Factor Xa)，可在洗脱后或柱上加入相应蛋白酶进行切割。

　　柱上切割优势：切下的目标蛋白流出，GST标签和未切开的融合蛋白仍留在柱上，一步实现分离，无需二次过柱。

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