蛋白质检测与分析

　　蛋白质检测与分析 (Protein Detection and Analysis) 是生物化学、分子生物学、药物研发及临床医学的核心技术。它涵盖了从“有没有蛋白质”(定性)、“有多少”(定量)到“是什么结构/功能/修饰”(表征)的全过程。

　　1. 蛋白质定量分析 (Quantification)

　　目的：测定样品中蛋白质的总浓度，是后续实验(如Western Blot, 质谱)标准化的基础。

　　2. 分离与免疫检测 (Separation & Immunoassay)

　　目的：根据分子量、电荷或特异性抗原抗体反应，分离并检测特定目标蛋白。

　　A. 电泳分离 (Electrophoresis)

　　SDS-PAGE：基于分子量分离。加入SDS使蛋白带负电并变性，消除电荷和形状差异。

　　应用：纯度检查、分子量估算、制备胶条用于质谱。

　　2D-PAGE (双向电泳)：第一向基于等电点 (pI) (IEF)，第二向基于分子量 (SDS-PAGE)。

　　应用：复杂混合物的高分辨率分离，发现异构体。

　　Native-PAGE (非变性电泳)：保持蛋白天然构象和活性。

　　应用：研究蛋白复合物、酶活性分析。

　　B. 免疫印迹 (Western Blotting, WB)

　　流程：电泳分离 -> 转膜 (PVDF/NC膜) -> 封闭 -> 一抗孵育 (特异性识别) -> 二抗孵育 (带标记) -> 显色/发光检测。

　　地位：蛋白研究的“金标准”，用于验证特定蛋白的表达量、剪切形式或修饰状态。

　　2026趋势：毛细管电泳-Western (Simple Western) 自动化系统逐渐普及，实现定量更精准、通量更高、无需手工转膜。

　　C. 酶联免疫吸附 (ELISA)

　　类型：直接法、间接法、夹心法(常用，特异性z高)、竞争法。

　　特点：高通量(96/384孔板)，灵敏度极高(pg/mL级)，适合临床诊断和血清学检测。

　　D. 免疫组化/免疫荧光 (IHC / IF)

　　特点：在组织切片或细胞原位检测蛋白，保留空间位置信息。

　　应用：病理诊断(如癌症标志物HER2检测)、亚细胞定位。

　　3. 蛋白质组学与质谱分析 (Proteomics & Mass Spectrometry)

　　目的：大规模鉴定样品中的成千上万种蛋白质，分析序列、修饰及相互作用。这是目前前沿的领域。

　　核心流程：

　　样品制备：提取、还原、烷基化、酶解(常用Trypsin切成肽段)。

　　分离：液相色谱 (LC)，通常是纳升流率的反相色谱 (nano-LC)。

　　电离：电喷雾电离 (ESI) 或 基质辅助激光解吸 (MALDI)。

　　质量分析：

　　Orbitrap：超高分辨率，主流选择。

　　TOF/TOF：高速，适合MALDI成像。

　　Triple Quad (QqQ)：定量金标准 (SRM/MRM模式)。

　　数据分析：数据库搜索 (MaxQuant, Proteome Discoverer) 匹配谱图。

　　关键应用：

　　Shotgun Proteomics (鸟枪法)：鉴定复杂混合物中的所有蛋白。

　　翻译后修饰 (PTM) 分析：富集磷酸化、乙酰化、泛素化肽段，绘制修饰图谱。

　　定量蛋白组学：

　　标记法：TMT/iTRAQ (多重标记，一次跑多样品)，SILAC (细胞代谢标记)。

　　无标记 (Label-free)：成本低，适合样品数多的情况。

　　相互作用组学：Co-IP-MS (免疫共沉淀联用质谱) 寻找蛋白互作伙伴。

　　4. 结构与功能表征 (Structure & Function)

　　目的：解析蛋白的三维结构、折叠状态、动力学及结合亲和力。

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