mst浓度梯度实验操作流程

　　MST 浓度梯度实验(MicroScale Thermophoresis Concentration Gradient Experiment)是利用微量热泳动(MST)技术测定生物分子间相互作用亲和力( KdKd​ 值)的核心实验步骤。

　　该实验通过构建一系列不同浓度的配体(Ligand)溶液，与固定浓度的靶标分子(Target，通常被荧光标记)混合，检测复合物形成引起的热泳动信号变化，从而拟合出结合曲线。

　　实验操作流程 (以 NanoTemper Monolith 系列为例)

　　步骤 1：样品混合 (Mixing)

　　这是容易引入误差的步骤，需严格操作。

　　固定靶标浓度：在所有 16 个样品管中，加入等量的荧光标记靶标溶液，使z终混合液中的靶标浓度保持一致(例如均为 50 nM)。

　　加入配体梯度：

　　方法 A(直接稀释法)：先制备好 16 个不同浓度的配体溶液，然后分别与等体积的靶标溶液混合。

　　方法 B(原位稀释法，推荐)：

　　在第 1 管中加入高浓度配体 + 缓冲液 + 靶标。

　　从第 1 管吸取一定体积混合液移至第 2 管(含缓冲液 + 靶标)，混匀。

　　依次类推至第 15 管，第 16 管作为空白对照(仅含缓冲液 + 靶标，无配体)。

　　注意：每次移液后需充分混匀(涡旋或移液枪吹打)，并更换枪头以防交叉污染。

　　步骤 2：装样 (Loading)

　　将混合好的 16 个样品分别装入 MST 专用毛细管(标准毛细管或增强型毛细管，视分子大小和吸附情况选择)。

　　避免产生气泡(气泡会严重干扰激光检测)。

　　静置片刻(通常 5-10 分钟)，让液体稳定并达到室温平衡。

　　步骤 3：仪器检测 (Measurement)

　　将毛细管放入仪器转盘。

　　参数设置：

　　LED 功率：调整至荧光强度在z佳范围(通常绿色荧光 20-40%，红色 30-50%)，避免光漂白或信号过弱。

　　MST 功率：通常设为 20%-80%。对于弱相互作用或大分子，可适当提高功率以增强信号;对于易聚集样品，降低功率。

　　运行：启动程序。仪器会自动施加红外激光产生温度梯度，并记录荧光随时间的变化( FcoldFcold​ 和 FhotFhot​ )。

       来源：网络