测定结合亲和力的方法

　　测定分子间结合亲和力(Binding Affinity，通常以解离常数 KdKd​ 表示)是药物研发、化学生物学和基础生命科学研究的核心环节。根据研究体系(蛋白-小分子、蛋白-蛋白、核酸-蛋白等)、样品特性(纯度、稳定性、用量)及所需信息(仅 KdKd​ 或含动力学/热力学参数)，可选择多种互补技术。

　　按技术原理分类

　　1. 基于热力学的方法

　　(1)等温滴定量热法(ITC, Isothermal Titration Calorimetry)

　　原理：直接测量结合过程中释放或吸收的热量。

　　输出： KdKd​ 、 ΔHΔH (焓变)、 ΔSΔS (熵变)、化学计量比 nn 。

　　优点：

　　无需标记，溶液相;

　　提供完整热力学图谱;

　　金标准，结果可靠。

　　局限：

　　样品消耗大(蛋白 0.3–1 mg/次);

　　要求 ΔHΔH 显著(熵驱动结合难测);

　　KdKd​ 范围：1 nM – 10 μM(z佳)。

　　适用：机制研究、高价值靶点验证。

　　2. 基于分子运动/迁移的方法

　　(2)微量热泳(MST, MicroScale Thermophoresis)

　　原理：温度梯度下，结合导致分子热泳行为改变。

　　输出： KdKd​ 。

　　优点：

　　样品极省(<1 μg 蛋白);

　　耐受复杂缓冲液(血清、细胞裂解液、去垢剂);

　　KdKd​ 范围广：1 pM – 10 mM。

　　局限：

　　需荧光信号(可 intrinsic 荧光免标记);

　　不提供动力学参数。

　　适用：珍贵样品、膜蛋白、初筛、细胞裂解液中互作。

　　(3)表面等离子共振(SPR, Surface Plasmon Resonance)

　　原理：分子结合引起金膜表面折射率变化。

　　输出： konkon​ 、 koffkoff​ 、 Kd=koff/konKd​=koff​/kon​ 。

　　优点：

　　实时、无标记(分析物无需标记);

　　提供动力学信息;

　　KdKd​ 范围：10 pM – 100 μM。

　　局限：

　　需固定一方(可能失活);

　　小分子 MW <100 Da 时信号弱;

　　缓冲液要求高(避免非特异吸附)。

　　适用：抗体表征、药物筛选、动力学研究。

　　3. 基于稳定性的方法

　　(4)差示扫描荧光法(DSF / Thermal Shift Assay)

　　原理：结合提高蛋白热稳定性 → 熔解温度 TmTm​ 升高。

　　输出： ΔTmΔTm​ (间接反映结合)。

　　优点：

　　超低成本、高通量(96/384 孔板);

　　仅需 qPCR 仪;

　　快速初筛(1 天 >1000 化合物)。

　　局限：

　　不直接给出 KdKd​ ;

　　假阳性(如沉淀剂提高 TmTm​ )。

　　适用：苗头化合物筛选、结合条件优化。

　　进阶：通过 ΔTmΔTm​ vs [ligand] 曲线可估算 KdKd​ (需 Van't Hoff 分析)。

　　4. 基于荧光/发光的方法

　　(5)荧光偏振(FP)

　　原理：小分子标记荧光，结合大分子后旋转变慢 → 偏振增强。

　　输出： KdKd​ 或 IC₅₀(竞争实验)。

　　优点：均相、高通量。

　　局限：需合成荧光探针。

　　适用：已知靶点的 HTS。

　　(6)时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)

　　原理：供体-受体距离变化导致 FRET 信号改变。

　　优点：低背景、高灵敏度。

　　适用：蛋白-蛋白、蛋白-小分子(如激酶抑制剂)。

　　5. 基于分离的方法

　　(7)平衡透析 + LC-MS/UV

　　原理：小分子与蛋白共孵育，透析分离游离/结合态，定量游离浓度。

　　输出： KdKd​ 。

　　优点：适用于血浆蛋白结合率(PPB)测定。

　　局限：耗时长(24–48 h 平衡)。

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